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複数のアミノ酸生合成に関与していると予想される超好熱菌遺伝子クラスターの機能解析

预测参与多种氨基酸生物合成的超嗜热基因簇的功能分析

基本信息

批准号：
16013204
负责人：
星野貴行
金额：
$ 3.46万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013204/
关键词：
Pyrococcus horikoshii Thermus thermophilus Lys生合成 AAA pathway

项目摘要

1)Pyrococcus horikoshii推定Lys生合成クラスター遺伝子のThermus thermophilusを用いた遺伝学的解析T.thermophilusのLys、Leu、Arg生合成に関与する遺伝子を、耐熱性HPH遺伝子を用いて個別に破壊した。この株に対して、該当するP.horikoshiiの推定Lys生合成クラスター遺伝子を、pTT8をベースとした発現プラスミドに組み込んで導入し、該当するアミノ酸要求性の相補が認められるかどうかを検討した。その結果、PH1726/PH1724の導入により該当するlysTU変異を相補することが明らかになった。このことは従来の結果を裏付けるものであるが、PH1726/PH1724はleuCD変異の相補はせず、P.horikoshii遺伝子がbi-functionalな活性を有しているかどうかについてまでは明らかにすることができなかった。さらに、その他の遺伝子(PH1727,PH1722,PH1720,PH1718)については、LysおよびLeu/Arg要求性のいずれも相補しなかった。相補が認められたPH1726/PH1724の場合でも、細胞抽出液中に同タンパク質はほとんど検出されないレベルであったので、T.thermophilus内でのP.horikoshiiタンパク質の発現量が充分ではない可能性も考えられる。2)P.horikoshii遺伝子の大腸菌を用いた生化学的解析P.horikoshiiの該当遺伝子(PH1727,PH1726/PH1724,PH1722)を個別に、pET systemなどを用いて大腸菌で発現・大量生産し、酵素活性レベルで解析することを試みた。ほとんどの場合、目的タンパク質は不溶性画分に局在化しており、また酵素活性も検出されなかった。今後大腸菌を宿主とした発現系についても、さらに検討を加える必要がある。

1)Pyrococcus horikoshii putative Lys biosynthesis gene Thermus thermophilus genetic analysis T.thermophilus genetic analysis of Lys, Leu, Arg biosynthesis related to the gene, heat resistance HPH gene genetic analysis of individual The putative Lys of P. horikoshii were synthesized into the protein sequence of pTT8 and introduced into the protein sequence of pTT8. The protein sequence of pTT8 and pTT8 was analyzed. As a result, PH1726/PH1724 is introduced into the system and the difference between PH1726 and PH 1724 is added into the system. The results of this study are as follows: PH1726/PH1724 leuCD is different and complementary, P.horikoshii gene is bi-functional active. In addition, other genes (PH1727,PH1722,PH1720,PH1718) are required to complement each other. In the case of PH1726/PH1724, the amount of P.horikoshii in the cell extract is sufficient to detect the possibility of the occurrence of P.horikoshii in the cell extract. 2) Biochemical analysis of Escherichia coli using P. horikoshii gene (PH1727,PH1726/PH1724,PH1722) for individual detection, pET system development, Escherichia coli production, enzyme activity analysis. In the case of a disease, the enzyme activity of the disease is detected. In the future, the host of E. coli will be developed in a timely manner.