肝癌免疫遺伝子治療ウイルスベクターの基礎的研究

本年度はレンチウイルスに関する研究を中心に研究を進めた。HBVの表面蛋白を発現するベクターとしてS蛋白のS, M, Lに対応するベクターを作製した。HBVウイルスではこれらの蛋白が一定の比率で表面蛋白を構成していることが知られているため、これらの蛋白の比率を変えて検討した。またHCVに関してはE12, E1p7, E2, E2p7のそれぞれの組み合わせの共感染とE12,E1p7の単独感染にてウイルスを作製して検討した.またこれらの蛋白の発現についてはHBVに関しては市販のHBs抗体を用いたWestern blotを用い,HCVに関してはT7を用いたin vitro transcription and translationにて確認したところ良好な蛋白発現がみられた.これらの系を用いレンチウイルスベクターを作製したがこれらのベクターでのレポーター遺伝子の発現は認められなかった.今回検討したHBV, HCVいずれも培養細胞感染系が一般的ではなく,その検出感度も低いため培養細胞系への感染実験システムが確立されているダックB型肝炎ウイルス(DHBV)を用い検討した.HBVと同様にpreSとS蛋白を発現するベクターを作成して,その蛋白発現をウエスタンブロットにて確認した.その後ダック肝細胞の初代培養細胞を作製し,これらの細胞に作製したウイルス感染させluciferase assayにて検討した.コントロールのVSV-Gの表面蛋白を有するウイルスでは良好な発現を確認できたが,DHBV S蛋白を表面に発現するウイルスとその組み合わせでは発現は確認できなかった.これらの検討でレンチウイルスのパッケージを含めた更なる検討が必要であると考えられた.

本年度はレンチウイルスに関する研究を中心に研究を進めた。HBVの表面蛋白を発現するベクターとしてS蛋白のS, M, Lに対応するベクターを作製した。HBVウイルスではこれらの蛋白が一定の比率で表面蛋白を構成していることが知られているため、これらの蛋白の比率を変えて検討した。またHCVに関してはE12, E1p7, E2, E2p7のそれぞれの組み合わせの共感染とE12,E1p7の単独感染にてウイルスを作製して検討した.またこれらの蛋白の発現についてはHBVに関しては市販のHBs抗体を用いたWestern blotを用い,HCVに関してはT7を用いたin vitro transcription and translationにて確認したところ良好な蛋白発現がみられた.これらの系を用いレンチウイルスベクターを作製したがこれらのベクターでのレポーター遺伝子の発現は認められなかった.今回検討したHBV, HCVいずれも培養細胞感染系が一般的ではなく,その検出感度も低いため培養細胞系への感染実験システムが確立されているダックB型肝炎ウイルス(DHBV)を用い検討した.HBVと同様にpreSとS蛋白を発現するベクターを作成して,その蛋白発現をウエスタンブロットにて確認した.その後ダック肝細胞の初代培養細胞を作製し,これらの細胞に作製したウイルス感染させluciferase assayにて検討した.コントロールのVSV-Gの表面蛋白を有するウイルスでは良好な発現を確認できたが,DHBV S蛋白を表面に発現するウイルスとその組み合わせでは発現は確認できなかった.これらの検討でレンチウイルスのパッケージを含めた更なる検討が必要であると考えられた.