好酸好熱古細菌のエーテル脂質合成系酵素の研究

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研究対象として全ゲノム配列がすで解読され報告されている二つの古細菌の種(Methanocaldococcus jannashiiとThermoplasma acidophilum)を選んだ。まず、報告されたゲノム配列の中に目的とする酵素digeranylgerallylglycerylphosphate synthetase(DGGGPS)の遺伝子があるかどうかを検索したところ、それらしき遺伝子としてMJ0279とTA0996という番号のついている二つの遺伝子を発見した。そこで、その遺伝子を染色体DNAからPCR(試験管内遺伝子増幅)で増幅した。増幅した遺伝子を大腸菌内蛋白質発現用のベクターにクローニングした。そのベクターを用いて大腸菌細胞内で遺伝子にコードされた蛋白質の大量発現を行った。次いで、二つの古細菌の二つの遺伝子の内、発現量の多かったMJ0279に関して酵素の精製を行った。まず、大腸菌体を超音波破砕し細胞膜画分を得た。細胞膜画分をβオクチルグルコシドで処理することで、大腸菌細胞膜内に発現していた酵素蛋白質DGGGPSを可溶化した。可溶化した溶液を熱処理することにより大腸菌由来の蛋白質を熱変性させて除去した。その後、DEAE、ResourceQ,ハイドロキシアパタイトのカラムを通すことによりDGGGPS蛋白質を精製することに成功した。酵素蛋白質の酵素活性等の諸性質を決定することに成功した。DGGGPSは30kDaのペプチド鎖一本よりなる単量体分子で、その活性の至適温度は70℃、至適pHが6.0であることが分かった。