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好酸好熱古細菌のエーテル脂質合成系酵素の研究

嗜酸古菌醚脂合成酶的研究

基本信息

批准号：
04F04451
负责人：
山岸明彦
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

研究対象として全ゲノム配列がすで解読され報告されている二つの古細菌の種(Methanocaldococcus jannashiiとThermoplasma acidophilum)を選んだ。まず、報告されたゲノム配列の中に目的とする酵素digeranylgerallylglycerylphosphate synthetase(DGGGPS)の遺伝子があるかどうかを検索したところ、それらしき遺伝子としてMJ0279とTA0996という番号のついている二つの遺伝子を発見した。そこで、その遺伝子を染色体DNAからPCR(試験管内遺伝子増幅)で増幅した。増幅した遺伝子を大腸菌内蛋白質発現用のベクターにクローニングした。そのベクターを用いて大腸菌細胞内で遺伝子にコードされた蛋白質の大量発現を行った。次いで、二つの古細菌の二つの遺伝子の内、発現量の多かったMJ0279に関して酵素の精製を行った。まず、大腸菌体を超音波破砕し細胞膜画分を得た。細胞膜画分をβオクチルグルコシドで処理することで、大腸菌細胞膜内に発現していた酵素蛋白質DGGGPSを可溶化した。可溶化した溶液を熱処理することにより大腸菌由来の蛋白質を熱変性させて除去した。その後、DEAE、ResourceQ,ハイドロキシアパタイトのカラムを通すことによりDGGGPS蛋白質を精製することに成功した。酵素蛋白質の酵素活性等の諸性質を決定することに成功した。DGGGPSは30kDaのペプチド鎖一本よりなる単量体分子で、その活性の至適温度は70℃、至適pHが6.0であることが分かった。

Study like と seaborne して full ゲノム match column がすで solution 読され report されている two つの ancient の bacteria (Methanocaldococcus jannashii と Thermoplasma acidophilum) を choose んだ. まず, report されたゲノム match listed のに purpose とす digeranylgerallylglycerylphosphate る enzymes Synthetase (DGGGPS) の posthumous son 伝があるかどうかを検 cable したところ, それらしき posthumous son 伝として MJ0279 と TA0996 という mash のついている two つの heritage 伝 son を発 see した. そこで, その posthumous son 伝を chromosome DNA から PCR (the test tube but 伝 child rights) で rights of した. Rights of した heritage 伝 son を coliform protein 発 within current のベクターにクローニングした. そのベクターを with いて coliform intracellular で heritage 伝 son にコードされた protein の a lot 発 line now をった. The secondary でで, the secondary 伝 archaea <e:1>, the secondary 伝 cultural heritage 伝 are present in large quantities <s:1> ったMJ0279に related to て enzyme <s:1> refinement を line った. Youdaoplaceholder0, を of escherichia coli, ultrasound was used to break the 砕 cell membrane to extract を, resulting in た. Membrane draw points を beta オクチルグルコシドで処 Richard することで, coliform membrane に発 now していた enzyme protein DGGGPS を solubilization した. Soluble た solution を thermal treatment するとによ <s:1> coliform bacteria origin を protein thermal change させて removal た. After その, DEAE, ResourceQ ハイドロキシアパタイトのカラムを tong すことにより DGGGPS protein を refined することに success した. The properties such as enzyme protein, enzyme activity, etc. を determine するとにとに success <s:1> た. DGGGPS は 30 kda のペプチド lock a よりなる単 quantity body molecular で, その active の to optimum は a temperature of 70 ℃, and optimum pH 6.0 でがあることが points かった.