好熱イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

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高度好熱菌Thermus thermophilusを宿主として、本研究者が以前に開発した好熱菌細胞内蛋白質進化系を用いて常温菌であるBacillus subtilisのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の耐熱性を上昇させる実験を行った。野生型常温菌酵素を発現した好熱菌は酵素の耐熱性が低いためにロイシンを含まない培地中では61℃でも生育することは出来なかった。この菌株をもとに、自発的突然変異及びPCRを用いた変異導入を行うことによって生育温度の上昇した菌株を得る試みを行った結果、61℃、66℃、70℃、73℃と、次々と生育温度の上昇した菌株を得ることが出来た。これらの変異株からイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子をク-ニングしてその塩基配列を決定したところ、それぞれの生育温度上昇変異株に置いて、T308I、I95L/T308I、I95L/M292I/T308I、T22K/I95L/M292I/T308I、とイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の遺伝子に順次アミノ酸置換が生じていることが見いだされた。次いでそれぞれの遺伝子を大腸菌中で大量発現し、発現した変異酵素をクロマトグラフィーによって精製した。精製した変異酵素はいずれもKm、kcat等の酵素特性についてはほとんど変化が起きていなかった。一方それらの変異酵素の耐熱性は順次上昇していることが確認された。すなわち、それぞれの酵素の変性の中点温度は常温菌野生型が49℃であるのに対し、53℃、58℃、59℃、60℃と順次耐熱性が上昇していることが確認された。