好熱イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

基本信息

批准号：
08272229
负责人：
山岸明彦
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高度好熱菌Thermus thermophilusを宿主として、本研究者が以前に開発した好熱菌細胞内蛋白質進化系を用いて常温菌であるBacillus subtilisのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の耐熱性を上昇させる実験を行った。野生型常温菌酵素を発現した好熱菌は酵素の耐熱性が低いためにロイシンを含まない培地中では61℃でも生育することは出来なかった。この菌株をもとに、自発的突然変異及びPCRを用いた変異導入を行うことによって生育温度の上昇した菌株を得る試みを行った結果、61℃、66℃、70℃、73℃と、次々と生育温度の上昇した菌株を得ることが出来た。これらの変異株からイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子をク-ニングしてその塩基配列を決定したところ、それぞれの生育温度上昇変異株に置いて、T308I、I95L/T308I、I95L/M292I/T308I、T22K/I95L/M292I/T308I、とイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の遺伝子に順次アミノ酸置換が生じていることが見いだされた。次いでそれぞれの遺伝子を大腸菌中で大量発現し、発現した変異酵素をクロマトグラフィーによって精製した。精製した変異酵素はいずれもKm、kcat等の酵素特性についてはほとんど変化が起きていなかった。一方それらの変異酵素の耐熱性は順次上昇していることが確認された。すなわち、それぞれの酵素の変性の中点温度は常温菌野生型が49℃であるのに対し、53℃、58℃、59℃、60℃と順次耐熱性が上昇していることが確認された。

我们使用热嗜热细菌作为宿主，我们进行了一项实验，以使用嗜热细胞内蛋白质蛋白质进化系统，以增加室温细菌枯草杆菌的异丙基乳酸脱氢酶的耐热性。表达野生型室温酶的嗜热细菌由于酶的耐热性低而在不含亮氨酸的培养基中无法在61°C下生长。基于这种菌株，我们试图通过使用PCR自发突变和诱变来获得具有升高生长温度的菌株，因此，我们能够在一个接一个地，在61°C，66°C，70°C和73°C的情况下，在一个接一个地越来越多地增加生长温度的菌株。从这些突变体中淬灭异丙丙酸酯脱氢酶基因，以确定碱基序列。发现氨基酸取代是在每个菌株的生长温度浸入突变体中依次存在于异丙基甲酸酯脱氢酶的基因中。然后在大肠杆菌中以大量表达每个基因，并通过色谱纯化表达的突变酶。纯化的突变酶没有任何变化的酶特性，例如KM和KCAT。另一方面，已经证实这些突变酶的耐热性逐渐增加。也就是说，已经证实，在室温野生型中，贬低每种酶的中点温度为49°C，而耐热性逐渐增加到53°C，58°C，59°C和60°C。