好熱イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

• 批准号: 08272229
• 负责人: 山岸 明彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272229/
• 关键词: 蛋白質の耐熱性; 熱安定性; 進化分子工学; 高度好熱菌; イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素; Thermus thermophilus; Bacillus subtilis

高度好熱菌Thermus thermophilusを宿主として、本研究者が以前に開発した好熱菌細胞内蛋白質進化系を用いて常温菌であるBacillus subtilisのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の耐熱性を上昇させる実験を行った。野生型常温菌酵素を発現した好熱菌は酵素の耐熱性が低いためにロイシンを含まない培地中では61℃でも生育することは出来なかった。この菌株をもとに、自発的突然変異及びPCRを用いた変異導入を行うことによって生育温度の上昇した菌株を得る試みを行った結果、61℃、66℃、70℃、73℃と、次々と生育温度の上昇した菌株を得ることが出来た。これらの変異株からイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子をク-ニングしてその塩基配列を決定したところ、それぞれの生育温度上昇変異株に置いて、T308I、I95L/T308I、I95L/M292I/T308I、T22K/I95L/M292I/T308I、とイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の遺伝子に順次アミノ酸置換が生じていることが見いだされた。次いでそれぞれの遺伝子を大腸菌中で大量発現し、発現した変異酵素をクロマトグラフィーによって精製した。精製した変異酵素はいずれもKm、kcat等の酵素特性についてはほとんど変化が起きていなかった。一方それらの変異酵素の耐熱性は順次上昇していることが確認された。すなわち、それぞれの酵素の変性の中点温度は常温菌野生型が49℃であるのに対し、53℃、58℃、59℃、60℃と順次耐熱性が上昇していることが確認された。

Highly hot bacteria Thermus thermophilus を host と し て, before the researchers が に 発 し た hot bacteria cell protein evolution is を い て room temperature bacteria で あ る Bacillus subtilis の イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の heat resistance rising を さ せ る be 験 を line っ た. Wild type normal temperature bacteria enzyme を 発 now し た は hot bacteria enzyme の low heat resistance が い た め に ロ イ シ ン を containing ま な い in petty で は 61 ℃ で も fertility す る こ と は out な か っ た. こ の strains を も と に, since 発 sudden variations of vision and び PCR を い た - different import line を う こ と に よ っ て fertility temperature rising の し た strains を have to try み る を line っ た results, 61 ℃, 66 ℃, 70 ℃, 73 ℃ と, 々 と fertility temperature rising の し た strains を must る こ と が た. こ れ ら の - different strains か ら イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme heritage 伝 son を ク - ニ ン グ し て そ の salt base with column を decided し た と こ ろ, そ れ ぞ れ の bearing temperature rise - different strains に buy い て, T308I, I95L/T308I, I95L/M292I/T308I, T22K/I95L/M292I/T 308 I, と イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の posthumous son 伝 に progressive ア ミ ノ acid replacement が raw じ て い る こ と が see い だ さ れ た. Traces of time い で そ れ ぞ れ の 伝 child を coliform で 発 し now, 発 now し た - isoenzymes を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て refined し た. Refined し た - isoenzymes は い ず れ も の enzyme properties such as Km, kcat に つ い て は ほ と ん ど variations change since が き て い な か っ た. The heat resistance of the それら <s:1> variant enzyme <e:1> increases in sequence, and the て る る とが とが is confirmed to be された. す な わ ち, そ れ ぞ れ の の enzyme - sex の midpoint temperature は room temperature bacteria wild-type が 49 ℃ で あ る の に し seaborne, 53 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃ と progressive rising heat resistance が し て い る こ と が confirm さ れ た.

项目成果

Yamagishi,A.et al: "Pyrimidine biosynthesis genes (pyrE and pyrF) of an extreme thermophile,Thermus thermophilus." Appl.Environ.Microbiol.62. 2191-2194 (1996)

Yamagishi,A.等人：“极端嗜热菌，嗜热栖​​热菌的嘧啶生物合成基因（pyrE 和pyrF）。”

Akanuma,S.et al.: "Spontaneous tandem sequence duplications reverse the thermal stability of carboxyl-terminal modified 3-isopropylmalate dehydrogenase" J.Bacteriol.178. 6300-6304 (1996)

Akanuma,S.et al.：“自发串联序列重复逆转了羧基末端修饰的 3-异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性”J.Bacteriol.178。

Hayashi-Iwasaki,Y.at al.: "A Stable Intermediate in the Thermal Unfolding Process of a Chimeric 3-Isopropylalate Dehydrogenase Between a Thermophilic and a Mesophilic Enzymes." Protein Sci.5. 511-516 (1996)

Hayashi-Iwasaki, Y.at al.：“嗜热酶和嗜温酶之间的嵌合 3-异丙酸脱氢酶热解折叠过程中的稳定中间体。”

Okamoto,A.et al.: "An aspartate aminotransterase from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus HB8." J.Biochem.119. 135-144 (1996)

Okamoto,A.et al.：“一种来自极端嗜热细菌，嗜热栖​​热菌 HB8 的天冬氨酸转氨酶。”

Kotsuka,T.et al.: "Further Stabilization of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile,Thermus thermophilus,by a Suppress or Mutation Method." J.Bacteriol.178. 723-727 (1996)

Kotsuka,T.等人：“通过抑制或突变方法进一步稳定极端嗜热菌（嗜热栖热菌）的 3-异丙基苹果酸脱氢酶。”