好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

基本信息

批准号：
09261236
负责人：
山岸明彦
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は約350アミノ酸残基からなるサブユニットのホモダイマーであり、個々のサブユニットは立体構造上二つのドメインからなっている。常温菌酵素を出発材料として、ランダムな変異を導入し、耐熱性の上昇した酵素を選び出しそれを解析すると言う方法によって、常温菌と好熱菌の耐熱性の差を検討した。実験に用いているこの酵素はロイシン合成系に関与しているため、ロイシンを含まない倍地中での生育で酵素活性を比較することができる。常温菌酵素の遺伝子を導入した好熱菌は、常温菌酵素の耐熱性が低いために高温ではロイシンを含まない倍地中で生育できない。変異が入った結果高温で生育できるようになった好熱菌を複数株単離した。常温菌である枯草菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子の耐熱性上昇変異酵素の解析からドメインとドメインの境界におけるアミノ酸残基の疎水性の上昇が耐熱性の上昇に重要であることが示された。好熱菌および大腸菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は不可逆変性を行うために、これまで変性の熱力学定数を得ることが出来なかったが、種々の条件を検討した結果可逆的変性を行う条件を見出すことが出来た。この条件で尿素を用いて変性の過程を検討した結果以下のことが明らかとなった。変性は共に変性中間体を持つ2段階変性である。変性中間体は、2つのドメインのうちの片方だけが変成して2つのサブユニットは結合したままの状態にある。二つの酵素の耐熱性の差は天然状態と変性状態の差ではなく、天然状態と変性中間体の自由エネルギーの差によっている。さらに、二つの酵素の耐熱性の差は、最安定状態に置ける自由エネルギーの差ではなく自由エネルギーの温度依存性の差によっている。すなわち大腸菌の酵素では天然状態と変性中間体の自由エネルギーの温度依存性が大きいためにより低温で零となり、変性する。

异丙丙酸酯脱氢酶是由大约350个氨基酸残基组成的亚基的同型二聚体，每个亚基构型由两个结构域组成。通过使用室温细菌作为起始材料引入随机突变，检查室温细菌与嗜热细菌之间的耐热性差异，以增加耐热性并分析酶。实验中使用的这种酶参与了亮氨酸合成系统，因此在没有亮氨酸的双重土壤中生长时可以比较酶活性。引入室温酶基因的嗜热细菌在高温下无亮氨酸地面的两倍，因为室温酶具有低耐热性。分离出突变并允许在高温下生长的多种嗜热细菌。分析增加枯草芽孢杆菌的异丙基甲酸异丙酸酯脱氢酶基因的突变酶是一种室温细菌，表明，域之间氨基酸残基的疏水性增加对于域之间边界之间的疏水性对于增加热耐药性很重要。大肠杆菌的嗜热细菌和异丙基乳酸脱氢酶是不可逆的，因此直到现在才能使用变性的热力学常数，但是在检查各种条件后，发现有条件可以执行可逆的变性。在这些条件下，使用尿素检查了剥落过程后，以下揭示了以下内容：变性是两个修改的中间体的两步修改。在修改的中间体中，两个域中只有一个是变质的，并且两个亚基保持绑定。两种酶之间的耐热性差异不是由于天然和变性态之间的差异，而是自然和变性中间体的自由能的差异。此外，两种酶之间的耐热性差异不是由于可以放置在最稳定状态的自由能的差异，而是由于自由能的温度依赖性差异。换句话说，在大肠杆菌酶中，自然状态的自由能和贬低的中间体的温度依赖性很大，这会导致低温和变性。