好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

• 批准号: 09261236
• 负责人: 山岸 明彦
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261236/
• 关键词: 蛋白質安定性; イソプロピルリンゴ酸; 脱水素酵素; 進化分子工学; 蛋白質工学; 変性中間体; 自由エネルギー変化; 2段階変性

イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は約350アミノ酸残基からなるサブユニットのホモダイマーであり、個々のサブユニットは立体構造上二つのドメインからなっている。常温菌酵素を出発材料として、ランダムな変異を導入し、耐熱性の上昇した酵素を選び出しそれを解析すると言う方法によって、常温菌と好熱菌の耐熱性の差を検討した。実験に用いているこの酵素はロイシン合成系に関与しているため、ロイシンを含まない倍地中での生育で酵素活性を比較することができる。常温菌酵素の遺伝子を導入した好熱菌は、常温菌酵素の耐熱性が低いために高温ではロイシンを含まない倍地中で生育できない。変異が入った結果高温で生育できるようになった好熱菌を複数株単離した。常温菌である枯草菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子の耐熱性上昇変異酵素の解析からドメインとドメインの境界におけるアミノ酸残基の疎水性の上昇が耐熱性の上昇に重要であることが示された。好熱菌および大腸菌のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素は不可逆変性を行うために、これまで変性の熱力学定数を得ることが出来なかったが、種々の条件を検討した結果可逆的変性を行う条件を見出すことが出来た。この条件で尿素を用いて変性の過程を検討した結果以下のことが明らかとなった。変性は共に変性中間体を持つ2段階変性である。変性中間体は、2つのドメインのうちの片方だけが変成して2つのサブユニットは結合したままの状態にある。二つの酵素の耐熱性の差は天然状態と変性状態の差ではなく、天然状態と変性中間体の自由エネルギーの差によっている。さらに、二つの酵素の耐熱性の差は、最安定状態に置ける自由エネルギーの差ではなく自由エネルギーの温度依存性の差によっている。すなわち大腸菌の酵素では天然状態と変性中間体の自由エネルギーの温度依存性が大きいためにより低温で零となり、変性する。

イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme は about 350 ア ミ ノ acid residues か ら な る サ ブ ユ ニ ッ ト の ホ モ ダ イ マ ー で あ り, a 々 の サ ブ ユ ニ ッ ト は three-dimensional structure on two つ の ド メ イ ン か ら な っ て い る. Room temperature bacteria enzyme を 発 material と し て, ラ ン ダ ム な - different を import し rising, heat resistant の し た enzyme を び from し そ れ を parsing す る と said う method に よ っ て, normal temperature bacteria と hot bacteria の poor heat resistance の を beg し 検 た. Be 験 に with い て い る こ の enzyme は ロ イ シ ン GeChengXi に masato and し て い る た め, ロ イ シ ン を containing ま な い times in で の fertility で enzyme activity を compare す る こ と が で き る. Room temperature bacteria enzyme の heritage 伝 son を import し た hot bacteria は, room temperature bacteria enzyme の low heat resistance が い た め に high-temperature で は ロ イ シ ン を containing ま な い times in で fertility で き な い. Change が into った result high temperature で gives birth to で るようになった るようになった るようになった thermophilic bacteria を multiple strains 単 separate from た. Room temperature bacteria で あ る hay bacteria の イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme heritage 伝 son の heat resistance rise - isoenzymes の parsing か ら ド メ イ ン と ド メ イ ン の realm に お け る ア ミ ノ acid residues の 疎 water-based の rise が heat resistance rising の に important で あ る こ と が shown さ れ た. Hot bacteria お よ び coliform の イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme は irreversible - sex line を う た め に, こ れ ま で - sex の thermodynamics constant を must る こ と が out な か っ た が, kind of 々 の conditions を beg し 検 た results reversible - sex line を を う conditions show the す こ と が た. <s:1> <s:1> conditions で urea を use the <s:1> て variable <s:1> process を検 to obtain <s:1> た results the following <s:1> とが とが とが see ら となった となった となった となった The variable <s:1> co-に variable intermediate を holds a <s:1> 2-order variable である. - intermediate は, 2 つ の ド メ イ ン の う ち の piece side だ け が variations into し て 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト は combining し た ま ま の state に あ る. Two つ の enzyme の poor heat resistance の は natural state と - poor sexual state の で は な く, natural state と - sex intermediates の free エ ネ ル ギ ー の poor に よ っ て い る. さ ら に, two つ の enzyme の poor heat resistance の は, the most stable state に け る free エ ネ ル ギ ー の poor で は な く free エ ネ ル ギ ー の temperature dependency の poor に よ っ て い る. で す な わ ち coliform の enzyme は natural state と - sex intermediates の free エ ネ ル ギ ー の temperature dependency が big き い た め に よ り cryogenic で zero と な り, - す る.

项目成果

Suzuki,T.: "Screening of a mutant plasmid with high expression efficiency of GC-rich leuB gene of an extreme thermophile,Thermus thermophilus,in Eschericha coli" J.Bacteriol.121:. 1031-1034 (1997)

Suzuki,T.：“在大肠杆菌中筛选具有高表达效率的极端嗜热菌（嗜热栖热菌）富含 GC 的 leuB 基因的突变质粒”J.Bacteriol.121：。

deBruijn,F.,J.: "Bcterial Genomes:Physical Structure and Analysis" Chapman&Hall,New York, 793 (1997)

deBruijn,F.,J.：“细菌基因组：物理结构和分析”查普曼

Akanuma, S.: "Effect of polar side chains at position 172 on thermal stability of 3-isopropylm alate degydrogenas e from Thermus thermophilus." FEBS Lett.410. 141-144 (1997)

Akanuma, S.：“172 位极性侧链对来自嗜热栖热菌的 3-异丙丙酸脱氢酶 e 热稳定性的影响。”

Suzuki,T.: "Molecular and phylogenetic characterization of isopropylmalate dehydrogenase of a thermoacidophilic archaeon,Sulfolobus sp.strain7." J.Bacteriol.179,. 1174-1179 (1997)

Suzuki,T.：“嗜热嗜酸古菌 Sulfolobus sp.strain7 的异丙基苹果酸脱氢酶的分子和系统发育特征。”

Wallon,G.: "Purification、catalytic properties and thermostability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Escherichia coli" Biochim.Biophys.Acta,. 1337,. 105-112 (1997)

Wallon，G.：“来自大肠杆菌的 3-异丙基苹果酸脱氢酶的纯化、催化特性和热稳定性”Biochim.Biophys.Acta，1337，。