好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

• 批准号: 07280204
• 负责人: 山岸 明彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280204/
• 关键词: イソプロピルリンゴ酸; 脱水素酵素; 高度好熱菌; Thermus thermophilus; キメラ酵素; 進化分子工学; 熱安定性; 熱変性

1。耐熱性の低い遺伝子を高度好熱菌内に導入発現する系を開発し、耐熱性の上昇した酵素を進化的に得ることに成功した。高度好熱菌Thermus thermophilusのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の一部を常温菌(枯草菌)酵素の一部分と入れ替えたキメラ酵素は、好熱菌酵素に比べて耐熱性が低下している。キメラ酵素遺伝子で元々の好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を置き換えた好熱菌は、ロイシンを含まない培地中で高温では生育できなくなった。この酵素遺伝子に変異を起こさせることにより耐熱性のほぼ2倍に上昇したイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を得ることができた。これは、高度好熱菌における酵素進化的耐熱化の初めての例であり、これまで報告されている中等度好熱菌(Bacillus stearothermophilus:70℃まで生育)のこうした系に比べてスクリーニングの可能温度を10℃以上あげることができた。(論文1)2。次いで、得られた耐熱性の上昇したキメラ・イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素のX線結晶解析に基づく構造解析を行った。得られた耐熱性上昇酵素の一つでは、イソロイシンがロイシンに置換することによって、側鎖の回転角の異常が解消されることによって耐熱性が上昇していることがわかった。(論文3)3。上述の進化的方法によって耐熱化したキメラ酵素の他の一つでは好熱菌酵素のまだ採用していない耐熱化変異残基によって耐熱性が上昇していることがわかった。そこでその残基を高度好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素に導入することにより、高度好熱菌の酵素をさらに安定化することができた。このことは、常温菌のタンパク質に比べて耐熱性のかなり高い高度好熱菌の酵素といえども一残基の置換によって、まだ耐熱性を上昇させる余地を持っていることを示している。(論文5)キメラ・イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱変性過程をCDおよびDSCを用いて解析した。キメラ酵素は2段階の熱変性を示し、CD、DSCともに二つの過程でほぼ半分ずつの変化が観測された。おそらく本酵素においては、2つのドメインが、2段階の変性過程において別々に変性するものと推定された。(論文4)

1. Low heat resistance の い heritage 伝 son を highly hot bacteria within に import 発 now す る started を 発 し rising, heat resistant の し た enzyme を evolution of に る こ と に successful し た. Highly hot bacteria Thermus thermophilus の イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の a を part temperature bacteria (hay) enzyme の と into れ for え た キ メ は ラ enzyme, hot bacteria enzyme に than べ て low heat resistance が し て い る. Heritage キ メ ラ enzyme 伝 で son yuan 々 の hot bacteria イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme を buy き in え た hot bacteria は, ロ イ シ ン を containing ま な い で high temperature in the petty で は fertility で き な く な っ た. こ の enzyme heritage 伝 son に - different を up こ さ せ る こ と に よ り heat-resistant の ほ ぼ 2 times に rise し た イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme を must る こ と が で き た. こ れ は, highly hot bacteria に お け る enzyme in the evolution of early heat melt の め て の example で あ り, こ れ ま で report さ れ て い る medium degrees hot bacteria (Bacillus Stearothermophilus: 70 ℃ ま で fertility) の こ う し た department に than べ て ス ク リ ー ニ ン グ の may を temperature above 10 ℃ あ げ る こ と が で き た. (Paper 1)2 Time い で, ら れ た heat resistance rising の し た キ メ ラ · イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の X-ray crystal parsing に base づ く structure line を っ た. Have ら れ た rising heat resistant enzymes の a つ で は, イ ソ ロ イ シ ン が ロ イ シ ン に replacement す る こ と に よ っ て, side lock の planning back Angle の abnormal が null さ れ る こ と に よ っ て heat resistance rising が し て い る こ と が わ か っ た. (Paper 3)3 The の way evolution に よ っ て heat-resistant chemical し た キ メ ラ enzyme の he の つ で は hot bacteria enzyme の ま だ using し て い な い heat melt - different residues に よ っ て heat resistance rising が し て い る こ と が わ か っ た. そ こ で そ の residues を highly hot bacteria イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme に import す る こ と に よ り, highly hot bacteria の enzyme を さ ら に stabilization す る こ と が で き た. こ の こ と は, normal temperature bacteria の タ ン パ ク qualitative に than べ て heat-resistant の か な り い high altitude hot bacteria の enzyme と い え ど も a residue の replacement に よ っ て, ま だ heat resistance rising を さ せ る room を hold っ て い る こ と を shown し て い る. (article 5) キ メ ラ · イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の thermal - sex process を CD お よ び DSC を with い て parsing し た. The two-stage <s:1> thermal change of the キメラ enzyme を was measured by を, CD, and DSCと と に に the two-stage <s:1> process でほぼ and half of the ず が観 <s:1> が観 が観 change が観. お そ ら く this enzyme に お い て は, 2 つ の ド メ イ ン が, 2-stage の - sex process に お い て don't 々 に - sex す る も の と presumption さ れ た. (Paper 4

项目成果

Yasuda, M. et al: "The plasmid found in isolates of the acidothermophilic archaebacterium, Thermoplasma acidophilum." FEMS Microbiel. Lett. 128. 157-162 (1995)

Yasuda, M. 等人：“在嗜酸嗜热古细菌，嗜酸热原体的分离株中发现的质粒。”

Numata, K. et al: "Thermal stability of chimeric isopropylmalate dehydrogenase genes constructed from a thermophile and mesophile genes." Protein Engineering. 8. 39-44 (1995)

Numata, K. 等人：“由嗜热基因和嗜温基因构建的嵌合异丙基苹果酸脱氢酶基因的热稳定性。”

Bunnak, J. et al: "Orotate phosphoribosyltransferase from Thermus thermophilus: Overexpression in Escherichia coli, purification and characterization." J. Biochem.118. 1261-1267 (1995)

Bunnak, J. 等人：“来自嗜热栖热菌的乳清酸磷酸核糖基转移酶：在大肠杆菌中过度表达、纯化和表征。”

Tamakoshi, M et al: "Screening of stable proteins in an extreme thermophile, Theymus thermophilus." Mol. Microbiol.16. 1031-1036 (1995)

Tamakoshi, M 等人：“在极端嗜热菌（Theymus thermophilus）中筛选稳定蛋白。”

Okamoto, A.: "An Aspartate Aminotransferase from an Extremely Thermophilic Bacterium, thermus thermophilus HB8" J. Biochem.119. 135-144 (1996)

Okamoto, A.：“来自极端嗜热细菌嗜热栖热菌 HB8 的天冬氨酸转氨酶”J. Biochem.119。