好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

基本信息

批准号：
07280204
负责人：
山岸明彦
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1。耐熱性の低い遺伝子を高度好熱菌内に導入発現する系を開発し、耐熱性の上昇した酵素を進化的に得ることに成功した。高度好熱菌Thermus thermophilusのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の一部を常温菌(枯草菌)酵素の一部分と入れ替えたキメラ酵素は、好熱菌酵素に比べて耐熱性が低下している。キメラ酵素遺伝子で元々の好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を置き換えた好熱菌は、ロイシンを含まない培地中で高温では生育できなくなった。この酵素遺伝子に変異を起こさせることにより耐熱性のほぼ2倍に上昇したイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を得ることができた。これは、高度好熱菌における酵素進化的耐熱化の初めての例であり、これまで報告されている中等度好熱菌(Bacillus stearothermophilus:70℃まで生育)のこうした系に比べてスクリーニングの可能温度を10℃以上あげることができた。(論文1)2。次いで、得られた耐熱性の上昇したキメラ・イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素のX線結晶解析に基づく構造解析を行った。得られた耐熱性上昇酵素の一つでは、イソロイシンがロイシンに置換することによって、側鎖の回転角の異常が解消されることによって耐熱性が上昇していることがわかった。(論文3)3。上述の進化的方法によって耐熱化したキメラ酵素の他の一つでは好熱菌酵素のまだ採用していない耐熱化変異残基によって耐熱性が上昇していることがわかった。そこでその残基を高度好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素に導入することにより、高度好熱菌の酵素をさらに安定化することができた。このことは、常温菌のタンパク質に比べて耐熱性のかなり高い高度好熱菌の酵素といえども一残基の置換によって、まだ耐熱性を上昇させる余地を持っていることを示している。(論文5)キメラ・イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱変性過程をCDおよびDSCを用いて解析した。キメラ酵素は2段階の熱変性を示し、CD、DSCともに二つの過程でほぼ半分ずつの変化が観測された。おそらく本酵素においては、2つのドメインが、2段階の変性過程において別々に変性するものと推定された。(論文4)

1。我们开发了一种系统，其中低热耐药基因被引入高度嗜热细菌，并成功地实现了具有耐热特性增加的酶。嵌合酶已被高度嗜热细菌热嗜热细菌的一部分脱氢酶取代，与嗜热蛋白酶相比，其室温细菌的一部分（细菌木霉）酶的一部分已降低。嗜热细菌用嵌合酶基因代替了原始的嗜热异丙酸酯脱氢酶，不再能够在无亮氨酸培养基中的高温下生长。通过突变该酶基因，获得了几乎两倍的耐热性，从而增加了脱氢酶。这是在高度嗜热细菌中首次实现酶进化热的耐热性，并与先前报道的中等嗜热细菌的系统（芽孢杆菌嗜热菌：生长至70°C）相比，可能的筛选温度增加了10°C或更多。（论文1）2。接下来，根据X射线晶体学对获得的嵌合异丙酸酯脱氢酶的结构分析进行。发现获得的一种耐热抬高酶之一通过用亮氨酸代替异亮氨酸来增加耐热性，从而消除了侧链的异常旋转角。（论文3）3。已经发现，上述进化方法已经抗热的其他嵌合酶增加了耐热酶中尚未采用的耐热突变残基。因此，通过将残基引入高度嗜热的异丙酸酯脱氢酶中，可以进一步稳定高度嗜热细菌的酶。这表明，即使是高度嗜热酶，它们比室温细菌的耐热酶明显更抗性，仍然可以通过取代一种残基来增加耐热性能的空间。（论文5）使用CDS和DSC分析嵌合异丙酸酯脱氢酶的热变性过程。嵌合酶表现出两个热变性阶段，在两个过程中CD和DSC中观察到的几乎一半的变化。据推测，在这种酶中，两个域在两步变性过程中分别变性。（论文4）