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脳における神経伝達物質受容体の定量的局在解析と遺伝子改変動物の作製

大脑中神经递质受体的定量定位分析和转基因动物的创造

基本信息

批准号：
04F04709
负责人：
重本隆一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

GABA_A受容体のgamma2サブユニットを生体の脳で可視化し、その分子数を計測するために、まずどのようなタグを付加したgamma2サブユニットが検出に有利でかつ機能の阻害がないかを検討した。昨年度は、GABAA受容体の機能と局在をin vitroの系で調べるために、gamma2サブユニットノックアウト動物からの海馬の初代培養細胞のGABA_A受容体のクラスター化の障害とそのレスキューについての実験を行った。正常動物からの培養では、GABA_A受容体はシナプスと思われる点状のクラスターを多数形成したが、gamma2サブユニットノックアウト動物からの培養では、明瞭なクラスターが失われていた。これに対してlentivirusを使ってgamma2サブユニットを発現させると、点状のクラスターを復活させることができた。現在、5種類のタグを導入したgamma2サブユニットを発現させるlentivirusの作成が終了し、クラスター形成をレスキューできるかどうかを検討中である。また、同じlentivirusをin vivoの脳内に注入し、検出できるかどうかを検討したところ、GFP単体では良好な蛍光標識を認めたものの、GFPを付加したgamma2サブユニットを発現させたものでは、蛍光が非常に弱く現在プロモーターを換えて検討中である。ただクラスタリングが回復するかどうかは、GFPの免疫染色で確認することが可能となった。電気生理学的なGABAA受容体チャネル活性の検証は、充分な蛍光量が得られるコンストラストを行い、正常な性質を確認した上で遺伝子改変動物の作製を開始する予定である。

GABA_A receptor gamma2 receptor is used to visualize and measure the number of molecules in the organism. Last year, the function of GABAA receptor was regulated in vitro system, gamma2 receptor was regulated in primary culture cells of hippocampus from animals. In normal animals, GABA_A receptors are mostly formed in the form of dots. In normal animals, GABA_A receptors are formed in the form of dots. The virus was discovered in the form of a dot. Now, five kinds of virus are introduced into gamma2, and the creation of lentivirus is completed. The same lentivirus was injected into the vivo, detected, and detected. GFP monomer was well identified. GFP was added to gamma2. It was detected and detected. It is possible to confirm the presence of GFP by immunostaining. Electrophysiological identification of GABAA receptor activity, sufficient light to obtain the desired activity, confirmation of normal properties, and initiation of animal behavior.