脳における神経伝達物質受容体の定量的局在解析と遺伝子改変動物の作製

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GABA_A受容体のgamma2サブユニットを生体の脳で可視化し、その分子数を計測するために、まずどのようなタグを付加したgamma2サブユニットが検出に有利でかつ機能の阻害がないかを検討した。昨年度は、GABAA受容体の機能と局在をin vitroの系で調べるために、gamma2サブユニットノックアウト動物からの海馬の初代培養細胞のGABA_A受容体のクラスター化の障害とそのレスキューについての実験を行った。正常動物からの培養では、GABA_A受容体はシナプスと思われる点状のクラスターを多数形成したが、gamma2サブユニットノックアウト動物からの培養では、明瞭なクラスターが失われていた。これに対してlentivirusを使ってgamma2サブユニットを発現させると、点状のクラスターを復活させることができた。現在、5種類のタグを導入したgamma2サブユニットを発現させるlentivirusの作成が終了し、クラスター形成をレスキューできるかどうかを検討中である。また、同じlentivirusをin vivoの脳内に注入し、検出できるかどうかを検討したところ、GFP単体では良好な蛍光標識を認めたものの、GFPを付加したgamma2サブユニットを発現させたものでは、蛍光が非常に弱く現在プロモーターを換えて検討中である。ただクラスタリングが回復するかどうかは、GFPの免疫染色で確認することが可能となった。電気生理学的なGABAA受容体チャネル活性の検証は、充分な蛍光量が得られるコンストラストを行い、正常な性質を確認した上で遺伝子改変動物の作製を開始する予定である。