マイクロRNAの解析と発現ベクターの開発

siRNAやmiRNAなど、小さな機能性RNAが通常の神経新生や神経幹細胞の細胞増殖、成熟ニューロンへの分化誘導過程などとどのように関係しているのか、いくつかの報告が出ているが、その詳細な分子機構はまだ明らかになっていない。本研究では、脳神経領域で効率よく安定した機能性RNAの研究を行うために、機能性RNAのデリバリー系の開発と、その検討を行った。動物にsiRNAを導入するためにレンチウイルスコンストラクトを作成し、機能性RNA発現カセットが導入された感染細胞を識別するために、マーカーとしてGFPをともに発現する様に設計した。分化に影響を与えない緩衝液で懸濁され濃縮したレンチウイルス液をコントロールとし、siRNAを発現するレンチウイルスコンストラクトを、直接マイクロインジェクションによって神経新生が頻繁に起きる脳海馬領域に導入した。インジェクション後2ヶ月経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。この方法での導入デリバリー法とは別に、blood brain barrierを通過できるような薬剤(1.6Mアラビノース)の動物への導入法も検討した。頸動脈を取り出し、カテーテルで固定後アラビノースを注射、一定時間経過後レンチウイルス液を固定カテーテルから注入する。3週間経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。これらの結果から、脳に直接マイクロインジェクションを行った方法では、非常に効果的なGFPマーカーの発現と、表的遺伝子のノックダウンによる神経新生阻害現象が、インジェクション箇所である海馬Dantate Gyrus領域に確認できた。本研究成果をもとに、論文投稿の準備を現在進めている。

siRNAやmiRNAなど、小さな機能性RNAが通常の神経新生や神経幹細胞の細胞増殖、成熟ニューロンへの分化誘導過程などとどのように関係しているのか、いくつかの報告が出ているが、その詳細な分子機構はまだ明らかになっていない。本研究では、脳神経領域で効率よく安定した機能性RNAの研究を行うために、機能性RNAのデリバリー系の開発と、その検討を行った。動物にsiRNAを導入するためにレンチウイルスコンストラクトを作成し、機能性RNA発現カセットが導入された感染細胞を識別するために、マーカーとしてGFPをともに発現する様に設計した。分化に影響を与えない緩衝液で懸濁され濃縮したレンチウイルス液をコントロールとし、siRNAを発現するレンチウイルスコンストラクトを、直接マイクロインジェクションによって神経新生が頻繁に起きる脳海馬領域に導入した。インジェクション後2ヶ月経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。この方法での導入デリバリー法とは別に、blood brain barrierを通過できるような薬剤(1.6Mアラビノース)の動物への導入法も検討した。頸動脈を取り出し、カテーテルで固定後アラビノースを注射、一定時間経過後レンチウイルス液を固定カテーテルから注入する。3週間経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子やグリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。これらの結果から、脳に直接マイクロインジェクションを行った方法では、非常に効果的なGFPマーカーの発現と、表的遺伝子のノックダウンによる神経新生阻害現象が、インジェクション箇所である海馬Dantate Gyrus領域に確認できた。本研究成果をもとに、論文投稿の準備を現在進めている。