肝oval cell(幹細胞)の同定・分離と分化・増殖機構の分子細胞生物学的研究

1.マイクロアレイ法によるoval cell特異的な発現遺伝子の同定ラットに2-acetylaminofluorene (2-AAF)を5日間経口投与し、5日目に70%肝切除を行った。2-AAFについては術後4日間投与を継続した。肝切除術後1日、3日、5日、7日、10日、14日目にラットを擬死させ、血液および残存する肝臓を摘出した。また対照群として70%肝切除のみを行なった群および2-AAF投与のみの群を作成し、上記と同様の期日(AAFのみのモデルについては投与開始後)にサンプルの摘出を行なった。マイクロアレイにて網羅的遺伝子発現解析を行なうために、摘出した各サンプルからtotal RNAを抽出した。2.oval cellとオートファジーの関わりについてoval cellを介した肝再生においてオートファジーがどのように関わっているのか、生化学、免疫組織化学、超微形態学の手法を用いて検討した。オートフォゴソームのマーカー蛋白であるLC3とoval cellのマーカー蛋白の一つであるCK19の二重染色を行ったところ、肝切除後3日目(oval cellの出現時期)よりLC3陽性顆粒は特に管腔形成をしているCK19陽性細胞およびその周囲の細胞に認められ、その数は時間経過とともに増加した。LC3は、オートファジー誘導時にLC3-I (18kDの細胞質型)からLC3-II (16kDの膜付着型)に転換され、LC3-IIの量がオートファゴソーム形成と正の相関を示すことが知られている。各時点で肝組織の抽出液中のLC3の分子型をウエスタンブロッティング法で解析したところ、時間経過とともにLC3-IIの発現量が,増加するのを確認した。最後に透過電子顕微鏡を用いて超微形態を観察したところ、肝切除後3日目の切片においても管腔形成をしている細胞の周囲の肝細胞中に多くのオートファゴソームを認め、オートファジーがoval cellの出現や分化、さらに肝の再構築に深く関わっている可能性が示唆された。

1.マイクロアレイ法によるoval cell特異的な発現遺伝子の同定ラットに2-acetylaminofluorene (2-AAF)を5日間経口投与し、5日目に70%肝切除を行った。2-AAFについては術後4日間投与を継続した。肝切除術後1日、3日、5日、7日、10日、14日目にラットを擬死させ、血液および残存する肝臓を摘出した。また対照群として70%肝切除のみを行なった群および2-AAF投与のみの群を作成し、上記と同様の期日(AAFのみのモデルについては投与開始後)にサンプルの摘出を行なった。マイクロアレイにて網羅的遺伝子発現解析を行なうために、摘出した各サンプルからtotal RNAを抽出した。2.oval cellとオートファジーの関わりについてoval cellを介した肝再生においてオートファジーがどのように関わっているのか、生化学、免疫組織化学、超微形態学の手法を用いて検討した。オートフォゴソームのマーカー蛋白であるLC3とoval cellのマーカー蛋白の一つであるCK19の二重染色を行ったところ、肝切除後3日目(oval cellの出現時期)よりLC3陽性顆粒は特に管腔形成をしているCK19陽性細胞およびその周囲の細胞に認められ、その数は時間経過とともに増加した。LC3は、オートファジー誘導時にLC3-I (18kDの細胞質型)からLC3-II (16kDの膜付着型)に転換され、LC3-IIの量がオートファゴソーム形成と正の相関を示すことが知られている。各時点で肝組織の抽出液中のLC3の分子型をウエスタンブロッティング法で解析したところ、時間経過とともにLC3-IIの発現量が,増加するのを確認した。最後に透過電子顕微鏡を用いて超微形態を観察したところ、肝切除後3日目の切片においても管腔形成をしている細胞の周囲の肝細胞中に多くのオートファゴソームを認め、オートファジーがoval cellの出現や分化、さらに肝の再構築に深く関わっている可能性が示唆された。