ヒト人工染色体の細胞への導入方法の確立およびその応用に関する生物工学的研究

建立人类人工染色体进入细胞方法的生物技术研究及其应用

• 批准号: 05J09774
• 负责人: 東 恒仁
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kazusa DNA Research Institute (2006)Osaka University (2005)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J09774/
• 关键词: アルギン酸カルシウム; 人工染色体; Schizosaccharomyces pombe; モノクローナル抗体

アルギン酸カルシウムマイクロビーズを介したヒト人工染色体の細胞への導入方法を確立するにあたり、ヒト人工染色体のvitroでの安定性を高めることが不可欠であることが判明した。そのため、染色体の形態安定に寄与するタンパク質の探索を試みた。前年度までにヒト染色体を構成するタンパク質のカタログ化に成功していることから、これらのタンパク質のノックアウトを行ない、その表現型を観察することで染色体の安定化に寄与する因子の特定を試みた。ノックアウトの容易さ、および実験の速やかさから、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeを宿主として用いることとし、ヒト染色体タンパク質の分裂酵母ホモログ約80種類の細胞内局在を調べた後、染色体に局在が見られたタンパク質を順次ノックアウトした。その結果ヒト・分裂酵母でFACT complexを形成するSSRP1の分裂酵母ホモログをノックアウトした場合に細胞分裂に重篤な障害が発生することが判明した。SSRP1と共にFACTを形成するSPT16の分裂酵母ホモログのノックアウトも試みたがノックアウトラインは得られなかった。SSRP1ノックアウトラインでは細胞分裂速度の低下、クロマチン構造の変化が見られた。SSRP1と相互作用するタンパク質を同定するために、two-hybrid、およびtandem affinity purification tagを用いたタンパク質精製を行なった。その結果、分裂酵母SSRP1と分裂酵母SPT16との相互作用が確認されたことから、本研究までFACTが同定されていなかった分裂酵母において、初めてFACTの存在を示した。また分裂酵母FACTと相互作用するタンパク質として、apm-1、elongation factor1-α、RNA polymerase subunitなどが同定された。本研究により分裂酵母においてFACTがクロマチン構造の安定性に寄与していることが示唆された。FACTは保存性が非常に高いタンパク質の複合体であり、ヒトなどの高等真核生物においてもクロマチン・染色体構造の安定性や染色体分配に寄与している可能性が高いと推定されることから、ヒト人工染色体をvitroで扱うにあたり操作性を向上させることができる因子としての役割が期待される。

A method for introducing artificial chromosomes into cells was established. The study of chromosome morphology and stability In the past year, the chromosome composition of the chromosome was successfully determined, and the phenotype was determined. It is easy to use, fast to use, and fast to use. The host of Schizosaccharides pombe is about 80 kinds of intracellular organs. The chromosome organs are regulated in sequence. As a result, SSRP1 was identified as a factor in the formation of the FACT complex in the splitting yeast. SSRP1 and FACT are formed by SPT16 and are separated from each other. SSRP1: The speed of cell division is low, and the structure of cell division is changed. SSRP1: interaction, two-hybrid, tandem affinity purification tag The interaction between SSRP1 and SPT16 was confirmed, and FACT was identified in this study. Yeast FACT interaction with apm-1, elongation factor1-α, RNA polymerase subunit In this study, the stability of the structure of the split yeast was studied. FACT is highly conserved in higher eukaryotes, stable in chromosome structure, and highly probable in chromosome allocation. It is highly probable that artificial chromosomes will be vitro operable.

项目成果

Stimulated parametric emission microscopy

受激参量发射显微镜

• 发表时间: 2006
• 期刊: Optics Express 14
• 作者: K. Isobe;et al.
• 通讯作者: et al.

Generation of monoclonal antibodies against chromosomal proteins that have a high sequence similarity between human and mouse

生成针对人类和小鼠之间具有高度序列相似性的染色体蛋白的单克隆抗体

• 发表时间: 2005
• 期刊: Journal of Biotechnology Vol.120
• 作者: Isobe K;et al.;Keisuke Isobe et al.;Susumu Uchiyama et al.;Tsunehito Higashi et al.
• 通讯作者: Tsunehito Higashi et al.

Multi-Spectral Two-Photon Excited Fluorescence Microscopy Using Supercontinuum Light Source

• DOI: 10.1143/jjap.44.l167
• 发表时间: 2005-01
• 期刊: Japanese Journal of Applied Physics
• 影响因子: 1.5
• 作者: K. Isobe;W. Watanabe;S. Matsunaga;T. Higashi;K. Fukui;K. Itoh

Development of a multistage classifier for a monitoring system of cell activity based on imaging of chromosomal dynamics

• DOI: 10.1002/cyto.a.20378
• 发表时间: 2007-05-01
• 期刊: CYTOMETRY PART A
• 影响因子: 3.7
• 作者: Gambe, Arni E.;Ono, Rika Maniwa;Fukui, Kiichi
• 通讯作者: Fukui, Kiichi

Intracellular disruption of mitochondria in a living HeLa cell with a 76-MHz femtosocond laser oscillator

使用 76 MHz 飞秒激光振荡器对活 HeLa 细胞中的线粒体进行细胞内破坏

• 发表时间: 2005
• 期刊: Optics Express Vol.13
• 作者: Isobe K;et al.;Keisuke Isobe et al.;Susumu Uchiyama et al.;Tsunehito Higashi et al.;Tomoko Shimada et al.
• 通讯作者: Tomoko Shimada et al.