ヒト人工染色体の細胞への導入方法の確立およびその応用に関する生物工学的研究

建立人类人工染色体进入细胞方法的生物技术研究及其应用

基本信息

批准号：
05J09774
负责人：
東恒仁
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kazusa DNA Research Institute (2006)Osaka University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

アルギン酸カルシウムマイクロビーズを介したヒト人工染色体の細胞への導入方法を確立するにあたり、ヒト人工染色体のvitroでの安定性を高めることが不可欠であることが判明した。そのため、染色体の形態安定に寄与するタンパク質の探索を試みた。前年度までにヒト染色体を構成するタンパク質のカタログ化に成功していることから、これらのタンパク質のノックアウトを行ない、その表現型を観察することで染色体の安定化に寄与する因子の特定を試みた。ノックアウトの容易さ、および実験の速やかさから、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeを宿主として用いることとし、ヒト染色体タンパク質の分裂酵母ホモログ約80種類の細胞内局在を調べた後、染色体に局在が見られたタンパク質を順次ノックアウトした。その結果ヒト・分裂酵母でFACT complexを形成するSSRP1の分裂酵母ホモログをノックアウトした場合に細胞分裂に重篤な障害が発生することが判明した。SSRP1と共にFACTを形成するSPT16の分裂酵母ホモログのノックアウトも試みたがノックアウトラインは得られなかった。SSRP1ノックアウトラインでは細胞分裂速度の低下、クロマチン構造の変化が見られた。SSRP1と相互作用するタンパク質を同定するために、two-hybrid、およびtandem affinity purification tagを用いたタンパク質精製を行なった。その結果、分裂酵母SSRP1と分裂酵母SPT16との相互作用が確認されたことから、本研究までFACTが同定されていなかった分裂酵母において、初めてFACTの存在を示した。また分裂酵母FACTと相互作用するタンパク質として、apm-1、elongation factor1-α、RNA polymerase subunitなどが同定された。本研究により分裂酵母においてFACTがクロマチン構造の安定性に寄与していることが示唆された。FACTは保存性が非常に高いタンパク質の複合体であり、ヒトなどの高等真核生物においてもクロマチン・染色体構造の安定性や染色体分配に寄与している可能性が高いと推定されることから、ヒト人工染色体をvitroで扱うにあたり操作性を向上させることができる因子としての役割が期待される。

在建立一种通过藻酸钙微粒引入人造人造染色体的方法时，已经发现，在体外增加人造染色体的稳定性至关重要。因此，我们试图寻找有助于染色体形态稳定性的蛋白质。自上一年以来，我们已经成功地对构成人类染色体的蛋白质进行了分类，我们试图通过淘汰这些蛋白质并观察其表型来确定有助于染色体稳定的因素。由于易于敲除和快速实验，我们决定使用裂变酵母裂菌酵母Pombe作为宿主，并在研究了大约80种类型的人类染色体蛋白的裂变酵母同源物的亚细胞定位后，我们依次将其脱离蛋白质的蛋白质在染色体上进行了局部。结果，发现当形成事实复合物的SSRP1的裂变酵母的同源物被淘汰在人类裂变酵母中时，就会发生严重的细胞分裂障碍。我们还试图淘汰SSRP1形成事实的SPT16的裂变酵母同系物，但没有获得敲门轮廓。 SSRP1敲除线显示细胞分裂速率降低和染色质结构的变化。为了鉴定与SSRP1相互作用的蛋白质，使用两个杂交和串联亲和纯化标签进行蛋白质纯化。结果，确认了裂变酵母SSRP1与裂变酵母SPT16之间的相互作用，并首先在裂变酵母中显示了事实的存在，在裂变酵母中，直到这项研究才发现事实。此外，已经确定了与裂变酵母菌相互作用的蛋白质，例如APM-1，伸长率因子1-α和RNA聚合酶亚基。这项研究表明，事实有助于裂变酵母中染色质结构的稳定性。事实是一种具有极高保护特性的蛋白质复合物，可以假定有助于染色质和染色体结构的稳定性以及诸如人类等较高的真核生物中的染色体分布，因此预计它可以在处理人类人工染色体时能够提高操纵性可操作性的因素。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Stimulated parametric emission microscopy

受激参量发射显微镜

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Optics Express 14
影响因子：
0
作者：
K. Isobe;et al.
通讯作者：
et al.

Generation of monoclonal antibodies against chromosomal proteins that have a high sequence similarity between human and mouse

生成针对人类和小鼠之间具有高度序列相似性的染色体蛋白的单克隆抗体

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Journal of Biotechnology Vol.120
影响因子：
0
作者：
Isobe K;et al.;Keisuke Isobe et al.;Susumu Uchiyama et al.;Tsunehito Higashi et al.
通讯作者：
Tsunehito Higashi et al.

Development of a multistage classifier for a monitoring system of cell activity based on imaging of chromosomal dynamics