クローン技術を応用した遺伝子組み換えラット作出に関する研究

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前年度では、ラットクローン胚作製の問題点の一つである排卵卵子の自発的活性化の制御ならびに活性化の適性条件に関する知見を得ることができた。本年度(最終年度)は、その条件を応用してクローン胚を作製し、体外および胎子発生能の確認試験を実施した。1.クローン胚作製のため、ドナー細胞の核移植法について検討した。ドナーにはWistar系ラット由来の精原細胞を用い、0.1μg/mlノコダゾールで処理した交雑種ラット由来の除核排卵卵子へ、電気パルス発生装置を用いた電気融合法、およびピエゾ装置を用いた直接注入法により核移植をはかった。その結果、直接注入法では卵子へのダメージが大きいために融合率は50%程度であったが、電気融合法(100V/mm、50μsec、2回)では80%程度と高率であった。2.卵丘細胞および精原細胞をドナーとして、電気融合法ならびに電気刺激による活性化処置により作製したクローン胚を修正R1ECM培地で体外培養し、体外発生能を検討した。その結果、卵丘細胞の場合は6%が胚盤胞へ発生したが、精原細胞の場合には全ての胚が8細胞期以前に発生を停止した。3.核移植後18-24時間体外培養したクローン胚を偽妊娠1日目のラットの卵管へ胚移植し、胎子発生能を検討した。その結果、卵丘細胞をドナーとした50個および精原細胞をドナーとした99個のクローン胚を移植したが、着床以降の胎子発生は一例も確認できなかった。4.クローン胚を用いたキメラ胚作製試験は、クローン胚の体外発生能が著しく低いため実施することができなかった。以上より、ラットクローン胚を体外培養により胚盤胞まで発生させる核移植実験系を構築することができた。しかしながらクローン個体を得るには至らず、現状では核移植法ならびに卵子の体外操作・培養系を修正があると考えられた。