小腸特異的な新規コレステロールトランスポーターの機能解析

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最近、中枢性の脂質蓄積症であるC型Niemann-Pick病の原因遺伝子であるNPC1と高い相同性を有するNPC1L1が同定され、この遺伝子をknock-outしたマウスでは顕著なコレステロール吸収の低下が観察された。このNPC1L1タンパク質は小腸の刷子縁膜に存在することが示されたことから、古くから消化管に存在すると考えられてきたコレステロールトランスポーターが、NPC1L1であることを示唆している。そこで我々はヒトNPC1L1遺伝子をクローニングし、この遺伝子の発現系を作成し、NPC1L1によるコレステロール輸送機構について検討を行った。まず、この蛋白質の細胞内局在を検討するため、蛍光性蛋白質であるGFPを融合させたGFP-NPC1L1を作成し、HEK293細胞に発現させた結果、その細胞内局在は細胞内小胞であることが示された。小腸においては、細胞膜の刷子縁膜側に局在していることから、その細胞膜局在は何らかの制御を受けているものと推察される。そこでNPC1L1の構造に着目し、NPC1L1の局在化機構について検討した。NPC1L1はステロールの基質認識に重要なsterol sensing domain(SSD)を有し、その近傍にゴルジ体から細胞膜へのタンパク輸送に関わるシグナルモチーフ(YQRL)が存在することを見出した。そこでこのシグナル配列について部位特異的変異法によりAQRLへ変換し、その局在について共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、変異体(AQRL)の局在は細胞膜において観察され、その発現量もwildタイプに比較して顕著に増加した。このことはNPC1L1の機能調節において、その細胞膜局在化が重要であり、その制御にはtrans-Golgi network signalが重要であることが示唆された。また、この変異体についてコレステロールの細胞内への輸送を評価した結果、有意なコレステロールの細胞内への蓄積が認められた。この輸送はプロトノフォアであるFCCP添加により顕著に低下したことから、NPC1L1はプロトンを駆動力としてコレステロールを輸送することが示唆された。しかし、その輸送活性はwild typeとほぼ同等であることから、NPC1L1によるコレステロール輸送には、NPC1L1の細胞膜局在に加え、何らかのNPC1L1の機能調節に関わるアクセサリータンパク等が必要であることが推察される。この詳細な機能は不明であるが、NPC1L1が恒常的に発現している細胞株等を用いて、NPC1L1の安定発現株の作成し、その機能評価を行う必要があると考えられる