小腸特異的な新規コレステロールトランスポーターの機能解析

小肠特异性新型胆固醇转运蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
16790107
负责人：
井上勝央
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

最近、中枢性の脂質蓄積症であるC型Niemann-Pick病の原因遺伝子であるNPC1と高い相同性を有するNPC1L1が同定され、この遺伝子をknock-outしたマウスでは顕著なコレステロール吸収の低下が観察された。このNPC1L1タンパク質は小腸の刷子縁膜に存在することが示されたことから、古くから消化管に存在すると考えられてきたコレステロールトランスポーターが、NPC1L1であることを示唆している。そこで我々はヒトNPC1L1遺伝子をクローニングし、この遺伝子の発現系を作成し、NPC1L1によるコレステロール輸送機構について検討を行った。まず、この蛋白質の細胞内局在を検討するため、蛍光性蛋白質であるGFPを融合させたGFP-NPC1L1を作成し、HEK293細胞に発現させた結果、その細胞内局在は細胞内小胞であることが示された。小腸においては、細胞膜の刷子縁膜側に局在していることから、その細胞膜局在は何らかの制御を受けているものと推察される。そこでNPC1L1の構造に着目し、NPC1L1の局在化機構について検討した。NPC1L1はステロールの基質認識に重要なsterol sensing domain(SSD)を有し、その近傍にゴルジ体から細胞膜へのタンパク輸送に関わるシグナルモチーフ(YQRL)が存在することを見出した。そこでこのシグナル配列について部位特異的変異法によりAQRLへ変換し、その局在について共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、変異体(AQRL)の局在は細胞膜において観察され、その発現量もwildタイプに比較して顕著に増加した。このことはNPC1L1の機能調節において、その細胞膜局在化が重要であり、その制御にはtrans-Golgi network signalが重要であることが示唆された。また、この変異体についてコレステロールの細胞内への輸送を評価した結果、有意なコレステロールの細胞内への蓄積が認められた。この輸送はプロトノフォアであるFCCP添加により顕著に低下したことから、NPC1L1はプロトンを駆動力としてコレステロールを輸送することが示唆された。しかし、その輸送活性はwild typeとほぼ同等であることから、NPC1L1によるコレステロール輸送には、NPC1L1の細胞膜局在に加え、何らかのNPC1L1の機能調節に関わるアクセサリータンパク等が必要であることが推察される。この詳細な機能は不明であるが、NPC1L1が恒常的に発現している細胞株等を用いて、NPC1L1の安定発現株の作成し、その機能評価を行う必要があると考えられる

最近，鉴定出与NPC1具有高同源性的NPC1L1，该基因是中枢脂质积累疾病的基因，并且在敲除该基因的小鼠中观察到胆固醇吸收的显着降低。该NPC1L1蛋白已被证明存在于小肠的刷子边界膜中，这表明NPC1L1是一种胆固醇转运蛋白，长期以来一直认为存在于胃肠道中。因此，我们克隆了人类NPC1L1基因，为该基因创建了一个表达系统，并研究了NPC1L1胆固醇转运的机理。首先，为了研究该蛋白质的亚细胞定位，通过与荧光蛋白GFP融合制备GFP-NPC1L1，并在HEK293细胞中表达它，表明其亚细胞定位是在细胞内囊泡中。在小肠中，它位于细胞膜的刷子边界侧，据估计细胞膜定位在某种控制下。因此，我们专注于NPC1L1的结构，并检查了NPC1L1定位的机理。 NPC1L1具有固醇感应结构域（SSD），对于固醇底物识别很重要，发现存在一个信号基序（YQRL）参与蛋白质从高尔基体到附近细胞膜的蛋白质转运。因此，通过位置突变将该信号序列转换为AQRL，并使用共聚焦激光显微镜观察到其定位。结果，在细胞膜中观察到突变体（AQRL）的定位，与野生型相比，其表达水平也显着增加。这表明细胞膜定位在NPC1L1函数的调节中很重要，并且该反式高尔基网络信号对其调节很重要。此外，由于评估了胆固醇到细胞中的转运，因此在细胞中观察到了胆固醇的显着积累。通过添加质子团FCCP大大降低了这种运输，这表明NPC1L1使用质子作为驱动力传输胆固醇。但是，由于其运输活性几乎与野生型相同，因此可以推断出，除了NPC1L1细胞膜的定位外，辅助蛋白，NPC1L1功能的调节所涉及的辅助蛋白还需要NPC1L1转运NPC1L1功能。尽管此详细的函数尚不清楚，但人们认为有必要创建NPC1L1的稳定表达菌株，并使用细胞系等评估其功能等，其中NPC1L1不断表达。