ES細胞から心筋細胞分化における核内転写調節蛋白のアセチル化制御機構の解明

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我々は胚性幹細胞(ES細胞)から心筋細胞への分化に必要な新規因子を網羅的に探索するため、心筋マーカー遺伝子であるNkx2.5の下流にGFPをノックインしたマウスES細胞株を用い、ランダム変異のハイスループット・スクリーニングを行った。レトロウイルスによって変異を挿入したES細胞を96-wellプレートで平面培養し、転写調節因子GATA-4の脱アセチル化を抑制するトリコスタチンA (TSA)によって心筋分化を誘導した。分化効率をGFPを指標にしたフローサイトメトリーによって測定した結果、有意に心筋分化が抑制されたクローンを複数得ることができた。3'RACEにより、クローンの一つでcAMP依存性タンパク質リン酸化酵素(PKA)の調節サブユニット遺伝子(PRKAR1B)が欠損していることを特定した。PRKAR1BはPKAと結合することによってその酵素活性を阻害し、cAMPと結合することによってPKAから解離する。cAMP/PKAシグナルがES細胞の心筋分化に関わっているかを調べるため、IBMXを投与して細胞内cAMP濃度を上昇させたES細胞の心筋分化効率を測定した。ES細胞からハンギング・ドロップ法により形成した胚様体に培養初期から継続的にIBMXを投与した結果、これらの胚様体ではTSAによる心筋分化効率が減少した。また、Nkx2.5およびGATA-4の発現量をRT-PCRによって定量した結果、IBMXを投与したES細胞ではこれらのRNA量が著名に減少していることがわかった。以上の結果は、PRKAR1BがES細胞の心筋分化に必要であり、cAMP/PKAシグナルの活性化が、心筋分化を抑制していることを示している。本研究はES細胞から心筋分化における新しいシグナルの探索として、その医学的・生物学的意義は大きいと考えられる。