2-デオキシストレプタミン生合成に関わる特異酵素群の基質認識機構及び反応機構解析

2-脱氧链霉胺生物合成中特定酶的底物识别和反应机制分析

• 批准号: 06J05731
• 负责人: 横山 健一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J05731/
• 关键词: 生合成; アミノ配糖体抗生物質; ラジカルSAM酵素; 糖転移酵素; 電子スピン共鳴; ブチロシン; ラジカル; 酸化反応

今年度はまず、2-デオキシストレプタミン含有型アミノ配糖体抗生物質ブチロシンの生合成に関して、昨年度その酵素機能を解明することができた、2-デオキシ-scyllo-イノサミン(DOIA)酸化反応を触媒するラジカルSAM(S-アデノシルメチオニン)脱水素酵素BtrNについて、EPRスペクトルを用いた反応機構解析を行った。まず、酵素反応溶液のEPRスペクトルを50Kにて測定することで、有機ラジカルのシグナルを観測することに成功した。重水素化した基質を用いた場合のスピン結合の消失パターンからDOIAの3位炭素上にラジカルが生じていることがわかった。一方、反応中の酵素の鉄硫黄クラスターについてもEPRスペクトルを用いて解析したところ、未反応のBtrN、BtrN-SAM複合体、BtrN-SAM-DOIA複合体と考えられるシグナルを観測することができた。基質の結合に伴ってシグナルの形状が大きく変化したことから、両基質がともに鉄硫黄クラスターのすぐ近傍に結合していると考えられる。以上の結果から、本酵素がラジカル機構の水酸基酸化反応を触媒することを分光学的に証明することができた。また、同じくDOS含有型アミノ配糖体抗生物質であるネオマイシンの生合成に関しては、DOS生合成以降の基本骨格構築を担う糖転移酵素の解明を目指し、組換え酵素の機能解析を行った。その結果、ネオマイシンが有する二つのアミノ糖の導入には二つの互いに独立した糖転移酵素、NeoDとNeoKが機能している一方で、その後の脱アセチル化に関しては単一の酵素、NeoLが繰り返し機能していることが明らかになった。NeoKは既知の糖転移酵素とはほとんど相同性を示さないため、新規な糖転移酵素ファミリーを形成しているものと考えられる。

Our は ま ず, 2 - デ オ キ シ ス ト レ プ タ ミ ン type contains ア ミ ノ glycoside antibiotic substances ブ チ ロ シ ン の biosynthesis に masato し て, yesterday's annual そ の enzyme function を interpret す る こ と が で き た, 2 - デ オ キ シ scyllo - イ ノ サ ミ ン (DOIA) acidification anti 応 を catalyst す る ラ ジ カ ル SAM (S - ア デ ノ シ ル メ チ オ ニ ン) dehydrated vegetable enzyme BtrN に つ い て, EPR ス ペ ク ト ル を with い た line analytical を 応 authorities っ た. ま ず, enzyme reverse 応 solution の EPR ス ペ ク ト ル を 50 k に て determination す る こ と で, organic ラ ジ カ ル の シ グ ナ ル を 観 measuring す る こ と に successful し た. Heavy water element change し を た matrix with い た occasions の ス ピ ン combining の disappear パ タ ー ン か ら DOIA の three carbon on に ラ ジ カ ル が raw じ て い る こ と が わ か っ た. Objects in the side, anti 応 の enzyme の iron sulfur ク ラ ス タ ー に つ い て も EPR ス ペ ク ト ル を with い て parsing し た と こ ろ, not reverse 応 の BtrN, BtrN - SAM complexes, BtrN - SAM - DOIA complex と exam え ら れ る シ グ ナ ル を 観 measuring す る こ と が で き た. Matrix の combining に with っ て シ グ ナ ル の shape が large き く variations change し た こ と か ら, struck matrix が と も に iron objects sulfur ク ラ ス タ ー の す ぐ nearly alongside に combining し て い る と exam え ら れ る. の above results か ら, this enzyme が ラ ジ カ ル institutions の water acidification acid radical anti 応 を catalyst す る こ と を spectroscopy に prove す る こ と が で き た. ま た, with じ く DOS type contains ア ミ ノ glycoside antibiotic substances で あ る ネ オ マ イ シ ン の biosynthesis に masato し て は, DOS biosynthesis in basic bone building を bear う の sugar planning shift enzyme の interpret を refers し, line group analytic を in の え enzyme function っ た. そ の results, ネ オ マ イ シ ン が have す る two つ の ア ミ ノ sugar の import に は two つ の mutual い に independent し た planning to move sugar ferment, NeoD と NeoK が function し て い る で, そ の の ア off after セ チ ル change に masato し て は 単 の enzyme, NeoL が Qiao り return し function し て い る こ と が Ming ら か に な っ た. NeoK は know の sugar planning both shift enzyme と は ほ と ん ど identity を shown さ な い た め, new rules な sugar planning shift enzyme フ ァ ミ リ ー を form し て い る も の と exam え ら れ る.

项目成果

ネオマイシン生合成における配糖化機構の解明

阐明新霉素生物合成中的糖基化机制

• 发表时间: 2008
• 作者: H.Waki;S.Kim;M.Kojima;M.Muramatsu;脇 隼人;Kenichi Yokoyama;Kenichi Yokoyama;横山 健一
• 通讯作者: 横山 健一

Characterization and mechanistic study of a radical SAM dehydrogenase in the biosynthesis of butirosin

• DOI: 10.1021/ja072481t
• 发表时间: 2007-12-12
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Yokoyama, Kenichi;Numakura, Mario;Eguchi, Tadashi
• 通讯作者: Eguchi, Tadashi

2-デオキシストレプタミン生合成に関わるラジカルSAM脱水素酵素のEPRスペクトルを用いた反応機構解析

利用 EPR 谱分析参与 2-脱氧链霉胺生物合成的自由基 SAM 脱氢酶的反应机制

• 发表时间: 2008
• 作者: H.Waki;S.Kim;M.Kojima;M.Muramatsu;脇 隼人;Kenichi Yokoyama;Kenichi Yokoyama;横山 健一;横山 健一
• 通讯作者: 横山 健一

アミノ配糖体抗生物質の主要アグリコンである2-デオキシストレプタミンの菌種により異なる生合成

2-脱氧链霉胺（氨基糖苷类抗生素的主要苷元）的生物合成因细菌种类而异。

• 发表时间: 2007
• 作者: H.Waki;S.Kim;M.Kojima;M.Muramatsu;脇 隼人;Kenichi Yokoyama;Kenichi Yokoyama;横山 健一;横山 健一;横山 健一
• 通讯作者: 横山 健一

Involvement of Two DistinctN-Acetyl Glucosaminyltransferases and a Dual Functional Deacetylase in the Neomycin Biosynthesis

两种不同的 N-乙酰葡糖胺基转移酶和一种双功能脱乙酰酶参与新霉素生物合成

• 发表时间: 2008
• 期刊: ChemBioChem 9
• 作者: 木村 智之;ら;Kenichi Yokoyama
• 通讯作者: Kenichi Yokoyama