転写リズムを生成する核内機能複合体の同定と生体リズム調整剤の開発

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交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。生体リズムの形成維持を担う時計センターは、脳内視床下部に存在する視交叉上核(SCN)にある。SCNに発現する遺伝子群を網羅的に捕らえるため、高純度のSCN抽出RNA溶液を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。ここで得られた候補分子群の発現を確定する目的で、SCN組織切片を用いてさらにin situ hybridizationを行った。また、転写リズムの生成に関わる核内機能複合体の同定を目指し、時計発振ループの中枢因子PER2に結合する蛋白質(PER-binding protein,ここではPAPと呼ぶ)を検索した。PER2-PAP複合体を精製するため、Flagタグ付きのPER2蛋白質を発現する細胞株を作出した。PER2蛋白質が転写抑制因子として機能する特定の時間帯(血清刺激後8-14時間後)を狙って細胞を回収し、核抽出液に含まれるmPER2蛋白質複合体を抗Flag抗体カラムを用いてアフィニティー精製した。この複合体をグリセロールグラジエント法を用いてサイズ分画した後、アクリルアミドゲルに展開した。銀染色によって検出したタンパク質を質量分析解析に供し、PAPの候補となる新規分子を同定することに成功した。この分子の特性を知るため、組み換え蛋白質を調製し、これを抗原として使用することによりPAPを特異的に認識するための抗体を得た。