小脳LTD誘発時のシグナルインテグレーションをIP3可視化によって解明する

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応募者はこれまでに、急性小脳スライス標本のプルキンエ細胞において、緑色蛍光たんぱく質(GFP)とプレクストリンホモロジードメイン(PHD)の融合タンパク質GFP-PHDを用いたイノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)イメージングを成功させている。具体的には、GFP-PHDのcDNAをコードするシンドビスウイルスベクターをマウス小脳に注入し、小脳スライスを作製する。感染細胞においてGFP-PHDの細胞膜及び細胞質局在を解析することで、IP_3動態が明らかになる。二光子励起顕微鏡を用いることで脳スライスのように光散乱の大きい標本でも高解像度蛍光イメージングが可能となり、樹状突起の細部においてもGFP-PHDの局在を観察できる。平成18年度に引き続き平成19年度では単一スパインレベルの観察を目指した。LTD誘発シグナルの統合が単一スパイン内で起こる可能性を考慮に入れているためである。まず、従来よりも高開口数の対物レンズを用いることで解像度を向上させた。また、従来は細胞質及び細胞膜部分に関心領域を設定し蛍光強度変化を観察するという単純な蛍光局在解析を行ってきたが、画像上の蛍光強度分布の分散値による局在の評価等より感度の高い解析法を模索した。加えてGFP-PHDのGFP部分を赤色蛍光タンパク質に変更することで、長くなった蛍光波長により散乱が抑えられ解像度が向上することが期待できるので、現在当該コンストラクトを作成している。また細胞内IP_3動態には神経伝達物質である細胞外グルタミン酸の動態が深く関与するので、これの可視化解析にも着手した。