ヒト癌細胞の足場非依存的増殖能の獲得におけるSrcの役割

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前年度の研究で、SrcのネガティブレギュレーターであるCskを欠損した正常線維芽細胞(CskKO)は、正常細胞型Srcを発現させることによって足場非依存的増殖能を獲得し、トランスフォーメーションすることを見出した。この系は、細胞内蛋白質のリン酸化亢進が限定的でトランスフォーメーションに最小限必要なSrc基質を見出すことが容易となっている。そこで本年度は、足場非依存性に関わるSrcの基質を見出すために、CskKO細胞あるいはCskKO-Src細胞の足場欠損状態における細胞内チロシンリン酸化蛋白質のパターンについてリン酸化チロシン特異的抗体を用いたウエスタンブロッテイングにより比較し、CskKO-Src細胞でリン酸化されCskKO細胞でリン酸化が見られなくなる蛋白質をプロテオーム的手法で同定した。一方で、前年度にマイクロアレイ法を用いて解析したSrcによるトランスフォーメーション形質に伴って発現が変動する遺伝子についてRT-PCRによって遺伝子の発現変動を確認した。以上の方法から、トランスフォーメーション形質と発現の減少が相関している分子としてCsk結合蛋白質であるCbpを見出した。CbpをCskKO-Src細胞に過剰発現することによって、そのトランスフォーメーションに対する抑制効果を確認し、さらにヒト大腸癌由来上皮細胞株(ヒト癌細胞の中でも特にSrcが活性化していることで知られる)を用いて、Cbpのヒト癌細胞における機能を解析した。