HCV持続感染に関わる肝内免疫環境の解析と肝細胞由来HSPを用いた寛容破綻の誘導

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§HCV発現肝細胞由来HSP gp96・20Sプロテアソームの精製とDCパルスの基礎的検討CN2マウスのHCV蛋白発現肝細胞、非発現肝細胞を分離、ホモジナイズし超遠心後の上清をCon-Aセファロースカラムに通し結合分画を得た分画を、MonoQカラムを用いNaCl勾配によるFPLCにより分画して、ERに存在するHSPのgp96に対するモノクローナル抗体を用いたSDS-PAGEによりgp96含有分画を得た。ついで、MHC分子により提示される抗原ペプチドを切り出す能力が高く、実質細胞による内在性抗原の提示に深く関わる免疫プロテアソーム構成ユニット20Sプロテアソームを精製した。骨髄細胞からMACSを用いDC前駆細胞を分離し、rGM-CSF、rIL-4を添加し24時間培養後にモノクローナル抗体を用いgp96受容体CD91陽性分画をポジテイブセレクションして得たDCにHCV蛋白発現肝細胞から分離したgp96または20Sプロテアソームをパルスし、さらにrGM-CSF、rIL-4を添加し24時間培養してDCを成熟させ抗原提示能を増強させた。こうして得られたgp96または20SプロテアソームをパルスしたDCとナイーブT細胞を混合培養し、HCV蛋白発現肝細胞を標的細胞、刺激を受けたT細胞を標的細胞に用いたCTLアッセイを行い、HCV発現肝細胞由来gp96・20SプロテアソームのHCV特異的免疫誘導能を検討したところ、T細胞の増殖はわずかに認められるものの、コントロールと比べて有意差を認めなかった。また、T細胞のThl、Th2サイトカイン産生動態も有意差を認めなかった。