植物二次代謝におけるナフタレン骨格形成の分子機構

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植物二次代謝産物のナフタレン環形成機構を解明することを目標として、ナフトキノン系二次代謝産物であるシコニン誘導体を生産するムラサキ細胞培養系をモデルとし、ナフトキノン骨格形成に関すると思われる生合成酵素遺伝子の有力候補をカタログ化する研究アプローチをとった。シコニン生産が暗黒下に特異的である性質を利用してPCRセレクト・サブトラクション法を行い、暗黒下特異的に発現している約240クローンのリストを得た。その中からナフタレン骨格形成に関与する可能性の高い候補クローンを数種選び出し、発現の高いものから逐次全長cDNAを単離、異種間発現系を用いて組み換えタンパク質の作製を行った。それら組み換えタンパク質をシコニンのナフタレン環形成予想中間体と反応させ基質とするかどうかを網羅的に調べ、反応経路を決定することを試みた。候補遺伝子の中で本年度は、その発現パターンが最もシコニン生産とリンクしていたpolyphenol oxidase(PPO)のcDNA、 LePPO1に関して優先的に進め、まずは大腸菌発現系を用いて組み換えタンパク質を発現させた。一般的にPPOの基質とされる数種の化合物を用いて酵素活性を測定したところ、hydroquinoneを基質とする可能性が示唆された。しかしながらタンパク質の発現量は十分とは言えず、今後シコニンの予想中間体と反応させるにはむしろバキュロウイルスの系に移すのが適当と考え、昆虫細胞Sf9を用いて発現を試みた。その結果、組み換えLePPO1タンパク質の大量発現に成功した。また別の候補遺伝子であるberberine bridge enzyme様遺伝子であるLeFLO1、 P450であるgeraniol 10-hydroxylaseと類似したLeG10H1の全長cDNAの単離に成功し、それぞれ昆虫細胞発現系を用いて、いずれの組換えタンパク質も十分に発現させることができた。以上のように、シコニン生合成経路と生産調節に関する知見を総合し、ナフタレン環形成に関与すると考えられる最有力候補、3種類の全タンパク質の発現に成功し、ナフタレン環形成経路を決定するための基盤固めの研究を行った。