リン酸基転移およびその反応環境場制御に関わるタンパク質の構造生物学的研究

参与磷酰基转移的蛋白质的结构生物学研究和反应环境的控制

• 批准号: 07J05001
• 负责人: 西谷 優一
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J05001/
• 关键词: X線; 構造生物学; 酵素; 足場タンパク質

X線結晶構造解析によって,JSAP1ならびにAGM1の立体構造を明らかにすることを目的として,研究を進めた.JSAP1に関しては,全長での発現は困難であったため,ドメイン毎に分けて発現系を構築し,さらに結合するキナーゼとの共発現系を構築した.その結果,JNK結合ドメインとキナーゼJNK3との複合体において,クェン酸を沈殿剤とする条件で微結晶が得られた.結晶化条件の最適化を行ったところ,結晶を最長辺0.07mmまで成長させることができた.しかし,回折点を得ることはできなかった.動的光散乱法により,溶液状態での分子サイズの分布を調べたところ,精製サンプルは多分散の状態にあり,結晶化に適さないことが分かった.そこで,今までの精製条件に加えて,さらなるカラム精製を行った.また,結晶化条件の検索も同時に行い,タンパク濃度,温度,バッファー(pH)の最適化や,反応阻害剤AMP-PNPとの複合体の作成などを試みた.今現在結晶は得られていないが,ポリエチレングリコールを沈殿剤とする条件で凝集やオイルボール状のものが観察されており,これらをもとに引き続き条件検索を進めていく予定である.また,この精製サンプルを用いてCDスペクトルを測定し,二次構造の予測を行ったところ,タンパク質は大部分がα-ヘリックスを形成していることが明らかとなった.AGM1に関しては,大腸菌を用いた大量発現,精製を行い,得られたサンプルを用いて結晶化スクリーニングを行った.今現在結晶は得られていない.引き続き,結晶化条件の検索ならびに精製条件の検討を行う予定である.また必要であれば,構造が不安定なN末端,C末端を削除するなどの遺伝子改変を試みる予定である.

X-ray crystal structure analysis,JSAP1 and AGM1 three-dimensional structure to clarify the purpose of this study, research progress. JSAP 1 related to the development of the whole length of the difficult to develop, the development of each component of the system to build, now combined with the development of the system to build. As a result,JNK binds to JNK3 and the complex is crystallized under the same conditions. Crystallization conditions were optimized and the longest crystallization length was 0.07 mm.しかし,回折点を得ることはできなかった. Dynamic light scattering method, solution state, molecular dispersion distribution, refinement, dispersion, crystallization. The refining conditions are increased, and the refining is carried out. In addition, the crystallization conditions are optimized simultaneously, such as concentration, temperature, pH, and the preparation of AMP-PNP complexes. Now the crystal is in the middle of the crystal, and the crystal is in the middle of the crystal. For example, if a large number of bacteria are found in a large amount, they will be refined and crystallized. Now the crystals are coming out. The crystallization conditions and purification conditions are discussed in detail. The structure is unstable, the N terminal and C terminal are removed, and the genetic modification is attempted.