神経細胞死抑制因子ADNFの受容体の同定および細胞死抑制機構の解析

神经细胞死亡抑制剂ADNF受体的鉴定及细胞死亡抑制机制分析

基本信息

批准号：
07J11218
负责人：
鈴木宏昌
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

神経細胞栄養因子ADNFは、変異SOD1による運動神経細胞死を抑制し、in vivoにおいてALSモデルマウスの運動機能を改善することから、ALS治療候補薬として考えられる。本研究では、ADNFの臨床応用を目的として、ADNFの神経細胞死抑制機構の解明を行った。これまで、ADNF受容体候補分子としてADNF結合分子S1を同定し、S1がADNFの神経細胞死抑制活性に必須であること、さらにADNFの神経細胞死抑制機構には、チロシンキナーゼ、CaMKIVが含まれることが明らかとなっている。本年度は、主にそれらの分子の機能的関連性、特にADNFとS1の細胞内結合を検討した。ADNFは、ペプチド性リガンドであるにも関わらず細胞内に取り込まれて機能することが示唆されている。我々はまず、ADNFの細胞内局在およびS1との共局在をビオチン化ADNF、FITC-ADNFまたはADNFを免疫染色法により検討したが、抗体感度や溶解度の問題により検出できなかった。次に、ADNFの類似配列を有するHsp60の部分配列をADNFのC末端に融合させ、FLAG tagを融合したペプチドを用い検討したが、そのペプチド自身がADNF活性を示さなかった。以上より、現段階において、ADNFとS1の結合はin vitroでは認められるものの、in vivo細胞内結合は検討できなかった。しかし、S1のノックダウンによりADNFの効果が減弱することから、S1がADNFのシグナル伝達に含まれることは確実であり、より詳細なシグナル伝達機構の解明が今後の課題である。

神经营养因子ADNF被认为是ALS治疗的候选者，因为它抑制了由突变体SOD1引起的运动神经元死亡，并改善了体内ALS模型小鼠的运动功能。在这项研究中，我们研究了抑制ADNF中神经元细胞死亡的机制，其目的是ADNF的临床应用。到目前为止，ADNF结合分子S1已被鉴定为候选ADNF受体分子，并且已经揭示了S1对于ADNF的神经元细胞死亡抑制活性至关重要，并且ADNF中抑制ADNF神经元细胞死亡的机制包括酪氨酸Kinase和Camkiv。今年，我们主要检查了这些分子的功能关联，尤其是ADNF和S1的细胞内结合。已经提出，尽管是肽配体，但ADNF还是将ADNF纳入细胞和功能。我们首先通过免疫染色的生物素化ADNF，FITC-ADNF或ADNF进行了免疫染色，研究了ADNF的亚细胞定位，并与S1进行了共定位，但由于抗体敏感性和溶解度问题，无法检测到。接下来，将具有ADNF相似序列的HSP60的部分序列融合到ADNF的C端，并使用了融合到标记标签的肽，但肽本身并未显示ADNF活性。结果，尽管目前在体外观察到ADNF和S1之间的结合，但不能研究体内细胞内结合。但是，由于S1的敲低减轻了ADNF的效果，因此可以肯定的是，S1将包括在ADNF信号中，并且对信号机制的更详细的阐明将是未来的挑战。