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Study on structures, functions and applications of novel endo-type and exo-type glycoceramidases involved in glycosphingolipid metabolism

鞘糖脂代谢中新型内切型和外切型神经酰胺酶的结构、功能及应用研究

基本信息

批准号：
19380061
负责人：
ITO Makoto
金额：
$ 12.9万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

スフィンゴ脂質は、形質膜ミクロドメインに主として存在し、細胞内のシグナリングや細胞間の相互作用に重要な役割を演じている。本研究では、申請者らが発見した非リソソーム性スフィンゴ脂質代謝酵素の構造と機能について研究を行い、以下のような成果を上げた。先ず、哺乳動物の細胞質に存在するグルコシルセラミド(GlcCer)分解酵素(エキソ型グリコセラミダーゼ)をクローニングした。本酵素は、老化関連タンパク質クロトーのホモログ(KLrP)であった。本酵素の活性をRNAi で抑制すると、細胞内のGlcCer 量およびGlcCer骨格を持つ糖脂質量が減少することを見出し、KLrPが細胞の糖脂質代謝に関わっていることを示した。本酵素を大腸菌で大量に発現させ、グルコース及びガラクトースとの共結晶を作製し、X線結晶構造解析を行った。その結果、KLrPはαヘリックスとβストランドを8回繰り返す、典型的なTIMバレル構造を示すこと、β-ストランド4および7のC 末に存在するE165とE373がそれぞれ酸/塩基触媒残基、求核残基であることを証明した。また、本研究においてリソソーム性の中性セラミダーゼの結晶構造解析に初めて成功した。その構造は今までに報告のない新しいものであり、その触媒機構は亜鉛を触媒中心とすることを明らかにした。構造を解くことで、スフィンゴ脂質シグナリングや食餌由来のセラミドの代謝・消化への関与等、本酵素の多彩な機能が合理的に説明できた。一方、放線菌から単離したエンド型グリコセラミダーゼ(EGALC)の基質特異性を詳細に調べ、本酵素は6ガラ系列糖脂質に特異的に作用することを明らかにした。また、EGALC は加水分解のみならず糖鎖の転移反応も効率よく触媒することも明らかになった。この特異性を利用した、6-ガラ系列糖脂質の蛍光標識法及び微量定量法を開発し、その方法を用いて、病原性の原虫、糸状菌、及び食用海藻等に6-ガラ系列糖脂質が存在することを見出した。海藻から単離した6-ガラ系列糖脂質の構造解析を行い、その構造を1-phytyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-galactopyranosyl]- glycerol と同定した。このような構造の糖脂質は初めての報告である。

The main factors affecting lipid metabolism and plasma membrane metabolism are the intracellular and cellular interactions, which play an important role. This study is based on the applicant's findings on the structure and function of lipid metabolizing enzymes. In mammals, there is a high level of GlcCer activity in the cytoplasm. This enzyme is related to aging. The activity of this enzyme is inhibited by RNAi, and the amount of GlcCer in the cell and the quality of GlcCer in the bone matrix are reduced. This shows that KLrP is involved in the metabolism of glucose and lipid in the cell. The enzyme is produced in large quantities in Escherichia coli, and co-crystallized in X-ray crystallographic analysis. The results show that KLrP α-and β-forms are 8-fold, typical TIM structures are shown, β-forms are 4-fold and 7-fold, and E165 and E373 are 8-fold and 8-fold. In this study, the crystal structure analysis of the neutral phase of the solution was successfully carried out. The structure of the catalyst is now in progress. The catalyst is in progress. The structure of the enzyme is explained in detail, including the metabolism, digestion and other aspects of the origin of the food, and the colorful function of the enzyme. The specific effect of EGALC on the matrix of the enzyme is regulated in detail, and the specific effect of EGALC on the glycolipid of the enzyme 6 is clarified. EGALC is a catalyst for the decomposition of sugar and its degradation. The specificity of this method has been demonstrated by the use of fluorescence labeling and microquantitative methods for 6-glucolipid, and the existence of pathogenic protozoa, fungi, and edible algae. The structural analysis of 6-galactopyranosyl series glycolipids in algae was carried out, and the structure of 1-phytyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-galactopyranosyl]- glycerol was determined. The structure of sugar and lipid is reported.