ラマン分光法によるマウス受精卵の質の非破壊評価法及びイメージング技術の確立

今年度は受精卵発生過程のモニタリングの再現性確認実験とラマン装置の改良を行った。まず受精卵発生過程のモニタリングの再現実験では，ICR系統マウスの未受精卵・前核期・2細胞期・4細胞期・8細胞期の卵からラマンスペクトルを取得し，発生過程に伴う分子組成変化の分析を行った。測定にはCO2インキュベータ搭載の顕微ラマンシステム(Nanofinder)を用いた。主成分分析(PCA) の結果，発生に伴ってタンパク質に対する脂質成分の相対濃度が周期的に変化し，受精の前後でタンパク質の2次構造に変化があることが示唆された。またタンパク質の構造変化について詳細な解析を行ったところ，受精後βシートのバンド強度が小さくなり，一方αへリックスのバンド強度が強くなっていることが分かった。つまり，受精卵の発生に伴ってαへリックス2次構造の割合が多くなっていることが示唆された。さらに，チロシンダブレットの強度比（850/830 cm-1）を各卵割段階で計算したところ，OH基が初め強い水素結合をしていたものが，受精後一旦イオン状態を経由し，再び強い水素結合をしていることを示唆する結果が得られた。これらの結果を総合的に判断すると，受精後に開始された生命活動によりアミノ酸が生成され，その後αへリックス2次構造を持つタンパク質を生成していったと考えられ，以前の実験結果の再現性を確認することができた。また，測定装置についても検討を行った。倒立顕微鏡を用いたラマンシステムを使用した。レーザーをディッシュの底から照射し，培養ディッシュの蓋を開けることなく測定を行うことが可能となった。本装置を用いてマウス胚の測定を行ったところ，非常にS/N比のよいシグナルを取得することに成功した。このことにより，今後マウス胚を培養しながら経時的にラマン測定を行うことが可能となった。

今年度は受精卵発生過程のモニタリングの再現性確認実験とラマン装置の改良を行った。まず受精卵発生過程のモニタリングの再現実験では，ICR系統マウスの未受精卵・前核期・2細胞期・4細胞期・8細胞期の卵からラマンスペクトルを取得し，発生過程に伴う分子組成変化の分析を行った。測定にはCO2インキュベータ搭載の顕微ラマンシステム(Nanofinder)を用いた。主成分分析(PCA) の結果，発生に伴ってタンパク質に対する脂質成分の相対濃度が周期的に変化し，受精の前後でタンパク質の2次構造に変化があることが示唆された。またタンパク質の構造変化について詳細な解析を行ったところ，受精後βシートのバンド強度が小さくなり，一方αへリックスのバンド強度が強くなっていることが分かった。つまり，受精卵の発生に伴ってαへリックス2次構造の割合が多くなっていることが示唆された。さらに，チロシンダブレットの強度比（850/830 cm-1）を各卵割段階で計算したところ，OH基が初め強い水素結合をしていたものが，受精後一旦イオン状態を経由し，再び強い水素結合をしていることを示唆する結果が得られた。これらの結果を総合的に判断すると，受精後に開始された生命活動によりアミノ酸が生成され，その後αへリックス2次構造を持つタンパク質を生成していったと考えられ，以前の実験結果の再現性を確認することができた。また，測定装置についても検討を行った。倒立顕微鏡を用いたラマンシステムを使用した。レーザーをディッシュの底から照射し，培養ディッシュの蓋を開けることなく測定を行うことが可能となった。本装置を用いてマウス胚の測定を行ったところ，非常にS/N比のよいシグナルを取得することに成功した。このことにより，今後マウス胚を培養しながら経時的にラマン測定を行うことが可能となった。