靭帯骨化に関わる細胞集団とシグナル連関の解明

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東大病院で実施する脊椎手術において、切除する靭帯組織を回収し、サンプルをパラフィン包埋した後に組織切片を作成した。作成した切片を用いて、H&E、Alcian Blue、von Kossa、 Masson trichrome、 Safranin-O染色を行い、間葉系幹細胞マーカー（CD90、CD105）、軟骨細胞マーカー（Sox9）、腱細胞マーカー（Scx）、骨芽細胞マーカー（Runx2, Osx）、血管内皮細胞マーカー（CD31）を用いた免疫組織染色を重点的に実施し、靭帯が骨化していく過程でどのような細胞集団が観察されるかを調べた。特に、靭帯骨化の骨化様式について、間葉系細胞が軟骨細胞を経由して骨芽細胞に分化する形式と、間葉系細胞が直接骨芽細胞に分化する二通りの骨化様式が存在することを証明した。また、回収した様々な靭帯サンプルから細胞を単離し、細胞の判定に有用であった抗体を用いてFACSを行い、細胞を回収した。回収した細胞からmRNAを回収してリアルタイムRT-PCRを行い、靱帯細胞と間葉系幹細胞の二群の細胞が存在することを示した。その二群の細胞のうち靱帯細胞群にシリコンチャンバーを用いたメカニカルストレス負荷培養試験を行い、WntシグナルのactivatorであるRspo2が分泌され、間葉系幹細胞群に作用して靱帯骨化を引き起こしていることを明らかにした。その上流にはRac1/Ros等のメカニカルストレスによって活性化されると言われているシグナルが関連していることが考えられ、現在その証明を行っている状況である。