細胞増殖・分化に関わる蛋白質リン酸化酵素の新規基質スクリーニング法の開発

开发一种新的细胞增殖和分化蛋白激酶底物筛选方法

• 批准号: 20058012
• 负责人: 天野 睦紀
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20058012/
• 关键词: シグナル伝達; プロテオーム; 酵素; リン酸化

本研究では、細胞増殖や分化に係る細胞内シグナル伝達に中心的な役割を果たす蛋白質リン酸化に焦点をあて、蛋白質リン酸化酵素の基質の同定を効率的に行い、シグナルネットワークの全体像を理解することを目的としている。このために、蛋白質リン酸化酵素の触媒領域を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー法とショットガンLC-MS/MS解析を組み合わせた方法で相互作用蛋白質の網羅的解析を行い、基質のスクリーニングを行った。細胞質分裂制御に関与するRho-kinaseの触媒領域に対してラット脳ライセートを出発材料として用いて解析を行った。カラムの溶出画分をLC-MS/MS解析に供し、相互作用蛋白質の同定を行ったところ200以上の蛋白質を同定することが出来た。同定されたRho-kinaseの相互作用蛋白質の中には、これまでに報告のある既知の基質が複数含まれていた。このことから、本法により相互作用蛋白質として基質を得ることが可能であることが示された。新たに得られた相互作用蛋白質の幾つかについてin vitroでRho-kinaseによりリン酸化を受けるかを調べたところ、AP180, Doublcortin, Amyloid precursor proteinなどがリン酸化されることを見出した。さらにDoublecortinの主要なリン酸化部位がThr-42であること、細胞内でもThr-42がRho-kinase依存的にリン酸化されることを示唆するデータを得た。Doublecortinは神経特異的に発現する微小管安定化蛋白質であるが、Thr-42をグルタミン酸に置換した変異体ではこの機能が低下したことから、Thr-42のリン酸化によりDoublecortinの機能が調節されていることが示唆された。以上のことより、本法を用いて生理的な新規基質の濃縮・スクリーニングが可能になると期待される。

The aim of this study is to understand the role of intracellular enzymes in cell proliferation and differentiation, as well as the role of enzymes in protein acidification. LC-MS/MS analysis is a combination of methods for the analysis of interacting proteins and matrix enzymes. Cytokinases are related to cytokinesis control and are used in the catalytic field to analyze cytokinases. LC-MS/MS analysis of the dissolution profile provides the identity of interacting proteins, and the identity of proteins above 200 is determined. The same Rho-kinase interaction protein is reported in the matrix. This law is the basis for interacting proteins. The new interaction protein was found in vitro Rho-kinase, AP180, Doublcortin, Amyloid precursor protein. The main site of Doublecortin acidification is Thr-42, and the intracellular Thr-42 is Rho-kinase dependent. Doublecortin is a microtubule stabilizing protein that produces neuro-specific proteins such as Thr-42 and Thr-42. With the above points, we hope that this method will be able to be used to refine the concentration and purification of new physiological substrates.

项目成果

Rho-kinase and Rho family GTPase signaling

Rho 激酶和 Rho 家族 GTPase 信号转导

• 发表时间: 2008
• 作者: Ito H;Yoshimura N;Kurosawa M;Ishii S;Nukina N;Okazawa H.;天野睦紀;Mutsuki Amano
• 通讯作者: Mutsuki Amano

Rho-kinase Contributes to Sustained RhoA Activation through Phosphorylation of p190A RhoGAP

• DOI: 10.1074/jbc.m806853200
• 发表时间: 2009-02-20
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Mori, Kazutaka;Amano, Mutsuki;Kaibuchi, Kozo
• 通讯作者: Kaibuchi, Kozo

A proteomic approach for comprehensively screening substrates of protein kinases such as Rho-kinase.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0008704
• 发表时间: 2010-01-14
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Amano M;Tsumura Y;Taki K;Harada H;Mori K;Nishioka T;Kato K;Suzuki T;Nishioka Y;Iwamatsu A;Kaibuchi K
• 通讯作者: Kaibuchi K

Screening of Protein kinase Substrates by an Interactome Approach

通过相互作用组方法筛选蛋白激酶底物

• 发表时间: 2009
• 作者: 曽根雅紀;岡澤均;鍋島陽一;天野睦紀
• 通讯作者: 天野睦紀

蛋白質間相互作用を利用したキナーゼ基質の網羅的解析

利用蛋白质-蛋白质相互作用综合分析激酶底物

• 发表时间: 2009
• 作者: 曽根雅紀;鍋島陽一;岡澤均;天野睦紀
• 通讯作者: 天野睦紀