デュアルピンポイント蛍光標識プリオン蛋白質を用いたFRETによる立体構造解析

クロイツフェルト・ヤコブ病や牛海綿状脳症などのプリオン病は、異常な立体構造を持つプリオン蛋白質(異常型PrP)を原因とする致死性の神経変性疾患である。人や動物の脳内には正常な立体構造を持つプリオン蛋白質(正常型PrP)が存在しているが、何らかの要因で体内に侵入した異常型PrPが正常型PrPの構造を次々と異常型へ変換し、異常型PrPが脳内に蓄積することによって発病すると考えられている。このようなプリオン病を克服するには異常型PrPの詳細な構造を解明する必要があるが、不溶性などの理由から異常型PrPの構造解析は十分に行われていない。そこで本研究では、任意のアミノ酸部位二ヶ所を蛍光標識したデュアルピンポイント蛍光標識プリオン蛋白質(二重蛍光標識プリオン蛋白質)を作製し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて異常型PrPの構造解析を行う。昨年度はN末端およひC末端をBODIPY558およひBODIPY-FLで蛍光標識したプリオン蛋白質を合成したが、今年度はBODIPY558の標識部位を変えた5種類の二重蛍光漂識プリオン蛋白質の合成を行った。蛍光イメージャーを使って合成量を確認すると、5種類の二重蛍光標識プリオン蛋白質の合成量は、両末端を標識したプリオン蛋白質に比べて顕著に低<、合成効率の低下が認められた。二重蛍光標識プリオン蛋白質の濃度が低いとFRETの観測が困難になることから、無細胞蛋白質合成系において各アミノ酸が取り込まれ易くなるようにコドンを調整するなどPrP遺伝子の塩基配列の最適化を行った。この最適化配列を用いて合成を行った結果、合成量が25倍に増加した。今後、合成した6種類の二重蛍光標識プリオン蛋白質をグアニジン塩酸塩で変性処理し、蛍光スペクトルを測定して構浩解析を行う。また、プリオン蛋白質由来のアミロイド線稚断片と混合し、FRETによる構造変化の観測を行う。

クロイツフェルト・ヤコブ病や牛海綿状脳症などのプリオン病は、異常な立体構造を持つプリオン蛋白質(異常型PrP)を原因とする致死性の神経変性疾患である。人や動物の脳内には正常な立体構造を持つプリオン蛋白質(正常型PrP)が存在しているが、何らかの要因で体内に侵入した異常型PrPが正常型PrPの構造を次々と異常型へ変換し、異常型PrPが脳内に蓄積することによって発病すると考えられている。このようなプリオン病を克服するには異常型PrPの詳細な構造を解明する必要があるが、不溶性などの理由から異常型PrPの構造解析は十分に行われていない。そこで本研究では、任意のアミノ酸部位二ヶ所を蛍光標識したデュアルピンポイント蛍光標識プリオン蛋白質(二重蛍光標識プリオン蛋白質)を作製し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて異常型PrPの構造解析を行う。昨年度はN末端およひC末端をBODIPY558およひBODIPY-FLで蛍光標識したプリオン蛋白質を合成したが、今年度はBODIPY558の標識部位を変えた5種類の二重蛍光漂識プリオン蛋白質の合成を行った。蛍光イメージャーを使って合成量を確認すると、5種類の二重蛍光標識プリオン蛋白質の合成量は、両末端を標識したプリオン蛋白質に比べて顕著に低<、合成効率の低下が認められた。二重蛍光標識プリオン蛋白質の濃度が低いとFRETの観測が困難になることから、無細胞蛋白質合成系において各アミノ酸が取り込まれ易くなるようにコドンを調整するなどPrP遺伝子の塩基配列の最適化を行った。この最適化配列を用いて合成を行った結果、合成量が25倍に増加した。今後、合成した6種類の二重蛍光標識プリオン蛋白質をグアニジン塩酸塩で変性処理し、蛍光スペクトルを測定して構浩解析を行う。また、プリオン蛋白質由来のアミロイド線稚断片と混合し、FRETによる構造変化の観測を行う。