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プリオン蛋白質のデュアルピンポイント蛍光標識法の確立とその応用に関する研究

朊病毒蛋白双精确荧光标记方法的建立及应用研究

基本信息

批准号：
19659116
负责人：
武藤淳二
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

プリオン病は、脳内に存在するプリオン蛋白質(正常型PrP)の立体構造が異常型へ変化し、異常型PrPが蓄積して発病すると考えられている。しかし、正常型から異常型への構造変換メカニズムや異常型PrPの立体構造など未だに不明な点が多く、プリオン病の克服にはこれらの解明が必要である。これまで正常型PrPの立体構造は明らかにされているが、異常型PrPは不溶性などの理由から構造が未決定なため、異常型PrPの解析手法として蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に着目した。この技術を応用するため、今年度は、4塩基コドン法を用いてアミノ酸部位2ヶ所を蛍光標識した二重蛍光標識PrPの作製を試みた。昨年度の研究結果から、発現後の可溶性を考慮し、プリオン遺伝子の後半部(アミノ酸配列121-231番目)を組み込んだPrP発現プラスミドを用いた。変異導入キットを用いて遺伝子2ヶ所に改変を加え、N末端およびC末端を二重蛍光標識するPrP発現プラスミドを構築した。また、FRETを検出するためにBODIPY 558標識tRNAおよびBODIPY FL標識tRNAを合成した。これらの蛍光標識tRNAと構築したプラスミドを無細胞蛋白質合成系の反応液に添加し、30℃2時間加温して二重蛍光標識PrPの発現を行った。インキュベート後、反応液を用いてSDS-PAGEを行い、蛍光イメージャーによりBODIPY 558およびBODIPY FLで標識されているバンドを検出した。さらに、抗PrP抗体を用いたウェスタンブロット法により、このバンドが目的の二重蛍光標識PrPであることを確認した。現在、精製を行ってFRET解析を試みているところである。本研究によりPrPの二重蛍光標識法を確立したことから、様々な部位を二重蛍光標識したPrPの作製が可能となり、これらから得られるFRETデータは正常型および異常型PrPの構造解析に有用である。

The steric structure of the protein (normal PrP) was abnormal and abnormal PrP was accumulated in the disease. The structural transformation of normal type and abnormal type PrP is necessary to solve the problem of the three-dimensional structure of PrP. The three-dimensional structure of the normal PrP is clearly different from that of the abnormal PrP. The reason for the insoluble structure of the abnormal PrP is not determined. The analysis method of the abnormal PrP is called FRET. This technology is used in the production of 4-D fluorescent light. The results of last year's study include: (1) the solubility of the protein after discovery is considered;(2) the second half of the protein (121-231 of the amino acid sequence) is considered;(3) the protein is found in the middle of the application. A new method for the identification of PrP in the presence of a double-colored light marker at the N-terminal and C-terminal of the gene is proposed. BODIPY 558 identification tRNA and BODIPY FL identification tRNA are synthesized. The reaction solution of the cell-free protein synthesis system was added to the reaction solution, and the reaction solution was heated at 30℃ for 2 hours. After the separation, SDS-PAGE was used to run the reaction solution, and BODIPY 558 and BODIPY FL were used to run the reaction solution. In addition, anti-PrP antibodies were used to identify PrP by the double fluorescent method. Now, refine the FRET analysis. In this study, the double fluorescence identification method of PrP was established, and the structure analysis of PrP was useful.