In vivoイメージングによる唾液腺腺房細胞のカルシウム応答と分泌反応の解析

通过体内成像分析唾液腺腺泡细胞的钙和分泌反应

基本信息

批准号：
21791809
负责人：
根津顕弘
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

平成22年度は、in vivoでのラット顎下腺におけるCa^<2+>応答の測定法の改良と、IP_3バイオセンサーLIBRAvの顎下腺への導入を行った。ラット顎下腺開口部からCa^<2+>蛍光指示薬fura-2/AMを逆行性に注入し、顎下腺にfura-2を負荷した。Fura-2を負荷した顎下腺を蛍光顕微鏡で観察すると腺房および導管細胞を含めた組織全体に十分なfura-2蛍光が観察された。顎下腺局所に30G注射針を挿入しムスカリン受容体作動薬で刺激したところ、その投与した部位に大きなCa^<2+>の上昇が観察された。IP_3感受性を向上した改良型LIBRAv(cLIBRAvIIs)発現プラスミドを作成し、そこからウイルスベクターを作製した。ウイルスベクターにより培養細胞に発現させたcLIBRAvIIsを精製し、IP_3に対する反応性を調べたところ、cLIBRAvIIsはLIBRAvに比べIP_3に対する感受性が2倍以上高いことが確かめられた。精製したcLIBRAvIIを単離腺房細胞に導入した。ムスカリン受容体作動薬により腺房細胞のcLIBRAvIIsの蛍光比上昇が観察された。cLIBRAvIIs発現ウイルスベクターをラット顎下腺に逆行性に注入し、顎下腺にcLIBRAvIIsの導入を試みた。その結果、舌下腺では蛍光は認められず、顎下腺のみにcLIBRAvIIsの蛍光が観察された。さらに顎下腺を酵素処理で単離したところ、腺房細胞にcLIBRAvIIsが発現していた。しかし発現の割合は10～20%と低かった。またウイルスベクターを導入した顎下腺では、組織に炎症は認められないものの、導入していない顎下腺と比べ唾液分泌量の40～50%程度の低下が認められた。Fura-2やcLIBRAvIIsウイルスベクターの導入方法を改良することで、より精度の高いin vivoでのCa^<2+>とIP_3動態やそれに応答する唾液分泌反応の解析が可能となると考えられる。

在2010年，我们改进了在体内大鼠下颌腺中测量Ca^<2+>反应的方法，并将IP_3 Biosensor librav引入了下颌腺。 Ca^<2+>荧光指示剂FURA-2/AM通过大鼠的下颌腺开口逆行注射，并用Fura-2加载下颌腺。当在荧光显微镜下观察到带有Fura-2的下颌腺时，在整个组织中，包括腺泡和导管细胞在内，观察到足够的Fura-2荧光。当将30克针插入下颌腺并用毒蕈碱受体激动剂刺激时，在施用的部位观察到Ca^<2+>的大幅增加。生成了病毒载体的改进的库拉夫（clibraviis）表达质粒，具有改善的IP_3敏感性。使用病毒载体在培养细胞中表达的clibraviis纯化，并测试了它们对IP_3的反应性。已经证实，与Librav相比，Clibraviis对IP_3的敏感性是敏感的两倍以上。将纯化的clibravii引入分离的腺泡细胞中。由于毒蕈碱受体激动剂，观察到腺泡细胞中锁骨细胞的荧光比增加。将表达粘膜的病毒载体逆行注入大鼠的下颌腺，并尝试将clibraviis引入下颌腺。结果，在舌下腺体中未观察到荧光，仅在下颌腺体中观察到锁骨的荧光。此外，当通过酶处理分离下颌下腺时，在腺泡细胞中表达clibraviis。但是，发病率低为10-20％。此外，尽管与未引起的下颌腺体相比，唾液分泌量减少了40-50％，尽管在病毒载体引入的下颌腺体组织中没有炎症。通过改进引入Fura-2和clibraviis病毒载体的方法，可以认为可以更准确地分析体内Ca^<2+>和IP_3动力学，以及响应中的唾液分泌反应。