Crk特異的阻害剤の新規スクリーニングシステムによる同定と脳腫瘍治療への応用

点击翻译按钮获取中文摘要

特別研究員採用最終年目である今年度は、I.脳腫瘍細胞株KMG4を用いたisogenic cell-based screening systemの樹立:KMG4細胞と、そのCrkノックダウン細胞に、firefly-およびrenilla-luciferaseを遺伝子導入して、KMG4-Crki-FFおよび測G4-Mock-RL細胞を樹立する。KMG4細胞への遺伝子導入は、高効率遺伝子導入が見込めるレトロウイルス発現システムを使用しました。樹立した細胞株について(i)様々な細胞外マトリックスに対する接着能を、マトリックス・コーティング・ディッシュを用いた培養により比較した結果、Crkの発現低下によって、ラミニンに対する接着性が減弱することが明らかになった。(ii)運動能の比較は、Wound-healing assayにより行った。CrkノックダウンKMG4細胞では運動能が低下することが分かった。(iii)通常の増殖アッセイおよびSoft-agar colony formationアッセイを行った結果、Crkは、足場依存性・非依存性、双方の増殖に重要であることが判明した。(iv)ヌードマウスに細胞をインジェクションするxenograftモデルを用いて、in vivoにおける腫瘍形成能を比較した結果、CrkノックダウンKMG4細胞における、腫瘍形成能の低下が認められた。II.化合物ライブラリーのスクリーニング:同数のKMG-Crki-FFとKMG4-Mock-RLを96-well-plateにて培養し、そこにライブラリーから1種ずつ化合物を作用させ、Dual-Luciferase-AssayによりCrk発現を維持しているKMG4-Mock-RL細胞の増殖のみを抑制する(即ちrenilla luciferase活性のみを低下させる)化合物を同定する。スクリーニングに使用する化合物は、(将来的には数千の化合物を含むものを製薬会社との共同研究でおこなうことも視野に入れているが)当面は数百程度の標準阻害剤からなるものを使用する。標準阻害剤ライブラリー(SCADS Inhibitor Kit)は、既に癌研究所・矢守博士から譲渡を受けている。今まで化合物ライブラリーのスクリーニング:100種類化合物のスクリーニングを行いました。結果はうち1種類化合物(X)はKMG4-Mock(Crk発現が高い)細胞の増殖のみ阻害する傾向が見られました。III.in vitroでの検証(現在進行中):同定した化合物が真にCrk阻害剤として機能するか否かの検証を、KMG4細胞のみならず、数種の脳腫瘍細胞株(現在準備中)も用いて行う。