一分子観察によるリバースジャイレースの反応機構、及びその生理的意義の解明

リバースジャイレース(以下RG)は、DNAトポイソメラーゼという二本鎖DNAに作用するたんぱく質のひとつで、高温条件下(70℃以上)で二本鎖DNAの二重らせんの巻き数を増やす働きをもつ分子機械である。RGは好熱菌に特有のたんぱく質であり、その反応は、好熱菌の生育環境である高温でのDNAの熱変性を防ぐためにDNAをきつく巻きつけていると考えられている。本研究は、RIGの反応を一分子レベルでリアルタイムに観察することで、その反応のメカニズムを解明することが目的である。片端をガラス面に固定したDNAのもう片端に目印のためのビーズを結合させ、DNAの回転をビーズの回転としてとらえ、RGの反応を光学顕微鏡下で観察してきた。昨年度までの研究により、その回転速度が温度に依存し、反応開始には温度上昇にともなうDNAの熱変性が必要であることがわかった。本年度は特に、ビーズを回転させているRGの数を見積もることに焦点を絞った。観察溶液中のRGの濃度を幅広く(1.0pM-10nM)振ってみたところ、ビーズの回転がみられる確率は濃度に依存したのだが、その回転速度には変化がみられなかった。さらに、RGの濃度は一定に保ち、溶液中のDNAの濃度を変化させることで、RGとDNAの濃度比を振ってみても、回転する確率のみが変化し、回転速度は変化しなかった。また、RGの濃度が低いにもかかわらず、いったん回転したビーズは、一定温度ではいつまでもまわり続け、停止することはほとんどみられなかった。以上の本年度の研究結果から、RGは一個の分子でDNAをきつく巻きつけることができ、RGがDNAにいったん結合するとほとんど離れることなしに反応し続けることができるほどDNAに対する親和性が高いと考えられる。これらのことは、先行研究である多分子系の手法ではわからなかったことであり、本研究により初めて示すことができた。

リバースジャイレース(以下RG)は、DNAトポイソメラーゼという二本鎖DNAに作用するたんぱく質のひとつで、高温条件下(70℃以上)で二本鎖DNAの二重らせんの巻き数を増やす働きをもつ分子機械である。RGは好熱菌に特有のたんぱく質であり、その反応は、好熱菌の生育環境である高温でのDNAの熱変性を防ぐためにDNAをきつく巻きつけていると考えられている。本研究は、RIGの反応を一分子レベルでリアルタイムに観察することで、その反応のメカニズムを解明することが目的である。片端をガラス面に固定したDNAのもう片端に目印のためのビーズを結合させ、DNAの回転をビーズの回転としてとらえ、RGの反応を光学顕微鏡下で観察してきた。昨年度までの研究により、その回転速度が温度に依存し、反応開始には温度上昇にともなうDNAの熱変性が必要であることがわかった。本年度は特に、ビーズを回転させているRGの数を見積もることに焦点を絞った。観察溶液中のRGの濃度を幅広く(1.0pM-10nM)振ってみたところ、ビーズの回転がみられる確率は濃度に依存したのだが、その回転速度には変化がみられなかった。さらに、RGの濃度は一定に保ち、溶液中のDNAの濃度を変化させることで、RGとDNAの濃度比を振ってみても、回転する確率のみが変化し、回転速度は変化しなかった。また、RGの濃度が低いにもかかわらず、いったん回転したビーズは、一定温度ではいつまでもまわり続け、停止することはほとんどみられなかった。以上の本年度の研究結果から、RGは一個の分子でDNAをきつく巻きつけることができ、RGがDNAにいったん結合するとほとんど離れることなしに反応し続けることができるほどDNAに対する親和性が高いと考えられる。これらのことは、先行研究である多分子系の手法ではわからなかったことであり、本研究により初めて示すことができた。