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金属タンパク質をホロ化する金属シャペロンタンパク質の開発

开发将金属蛋白转化为全息体的金属伴侣蛋白

基本信息

批准号：
21655061
负责人：
櫻井武
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

金属シャペロン機能を示すことが期待される枯草菌のCotDの発現系を前年度構築したが,CotDは多数のシステイン残基を含むため空気酸化されやすく,単離出来なかった。今年度,大腸菌を宿主とする組換え体を培養・発現誘導した後,尿素と非イオン性界面活性剤TritonX-100で処理した後,沈殿をイオン性界面活性剤SDSと還元剤2-メルカプトエタノールで可溶化することによって精製することに成功した。CotDの銅(II)結合性を吸収および電子スピン共鳴スペクトルで調べたところ,銅(II)イオンはまず主鎖に結合した後,少なくとも2つのヒスチジン残基のイミダゾール基に結合することがわかった。1分子のCotAあたり5個以上の銅(II)イオンを結合できることから,CotDは期待通り極めて高い金属イオン結合能を有していることがわかった。しかしながら,CotDの単離条件の検討に時間を費やしたので,CotDのシャペロン機能の検討は,十分行えなかった。発表した論文はCueOの発現系にCotDを共発現させたものであるが,CotDの共発現効果は有為レベルではなかった。一般に金属タンパク質は組換え体が得られてもホロ化がネックとなり,タンパク質の有効利用に至らないことから,CotDの機能を検証する実験は次年度も継続する予定である。CotD機能の当面のターゲットとしているCotAの枯草菌での発現系の改良については,様々の分泌シグナルの利用に挑戦したが芳しい結果は得られなかった。また,高発現の妨げになる可能性のあるループに存在するプロリン残基に変異導入したが,CotAの発現量や機能には大きな変化はなかった。今後は,CotDのCu(II)シャペロン機能を分子レベルでより詳細に調べるとともに,銅以外の金属イオンのシャペロン機能についても検討する予定である。

The development system of CotD in Bacillus subtilis was constructed in the past year, and most of the CotD residues were isolated from the substrate. This year, Escherichia coli host cells were cultured, induced, and treated with Triton X-100, and then purified successfully. CotD copper (II) binding absorption and electron resonance, copper (II) binding after the main lock, less than two sets of residues of the base binding. 1 molecule of CotA 5 or more copper (II) CotD's single condition search time is very short,CotD's single condition search time is very short,CotD's single condition search time is very short. The paper announced that CotD has been co-discovered in CueO's discovery system, and the effect of CotD's co-discovery has been promising. General metal material composition change body can be used to make the material available to the user,CotD function test is confirmed in the next year. The function of CotD is to improve the production system of CotA, and the secretion of CotD is to improve the utilization of CotD. CotA is highly reactive and highly reactive. In the future,CotD Cu(II) can be selected from the molecular list, and metal other than copper can be selected from the molecular list.