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一酸化窒素還元から酸素還元への変換による呼吸酵素の分子進化

通过从一氧化氮还原到氧还原的转化呼吸酶的分子进化

基本信息

批准号：
16655069
负责人：
櫻井武
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

脱窒菌Halomonas halodenitrificansはヘムcを有する小サブユニットNorCと低スピンヘムb,高スピンヘムb_3および非ヘム鉄を有する大サブユニットNorBからなるヘテロダイマーコンプレックスである。大腸菌を宿主としてNorCを異種発現したところ,N末の膜アンカーが切断された状態で発現したが,ヘムcを含む部分には影響なく,電子移動機能を有していた。同様に,NorBを大腸菌を宿主として異種発現させたが,一酸化窒素還元機能は示さず,サブユニットの個別発現には成功しなかった。そこで,NorBの発現には,成熟酵素には存在しないORFがコードするNorQ, NorDが関係すると考え,この遺伝子も含めて発現系を構築したが,機能のある酵素は発現しなかった。次いで,H.halodenitrificans遺伝子がコードする総てのNOR遺伝子,NorC, NorB, NorQ, NorDを含んだ異種発現系を構築したところ,オーセンティックなNorと同じ吸収,MCD, ESRスペクトルを示す組換え体が得られた。この組換え体のNO還元活性を測定したところ,微弱ながら,活性を示し,世界で初めてNorの異種発現に成功した。次いで,Norが末端酸化酵素へと分子進化する過程を再現するため,非ヘム鉄を銅結合部位に変異させることを計画し,Norとチトクロムオキシダーゼのキメラ酵素の作成を試みたが,キメラ酵素は高次構造を適切にとることが出来なかった。この解決方法として,組換え体を点変異させることが計画されるが,異種発現体は酵素の収量が低いことから,研究期間内ではミュータントの作成までには至らなかった。異種及び同種発現によるミュータント作成は新しい大きなテーマとして設定する計画である。

Halomonas halodenitrificansはヘムcを有する小サブユニットNorCとlowスピンヘムb,高スピンヘムb_3および无ヘム鉄を有する大サブユニットN orBからなるヘテロダイマーコンプレックスである. Coliform host としてNorC を heterogeneous 発appear したところ, N end の membrane アンカーが cut されThe status of the device is not affected by the current condition, the part of the device is affected by the device, and the electronic mobile function is not affected by the device. Same as the host, NorB coliform host and heterogeneous 発 appear させたが, one acidification suffocation element reduction function は Show さず, サブユニットの individual 発には success しなかった.そこで,NorBの発appearsには, mature enzyme exists しないORFがコードするNorQ, NorD's relationship is the test, the remaining enzyme is the structure, the function is the enzyme, and the function is the enzyme. H. halodenitrificans 缝子がコードする総てのNOR缝子,NorC, NorB, NorQ, NorDをcontains the heterogeneous system をconstructs したところ,オーセンティックなNorと同じabsorption,MCD, ESR スペクトルを showed that the group changed the body and got the られた.この group replacement of body の NO reduction activity を determination したところ, weak ながら, activity を indication し, world でめて Nor の heterogeneous 発ににした. Secondary いで,Norがterminal acidifying enzyme へとmolecular evolution する process をreproduction するため, non-ヘム鉄をcopper binding site に変different させることをplan し, Nor's enzymes are made and testedが, キメラ enzyme は high-order structure をにとることがなかった.このsolution として, group replacement えbody をpoint difference させることが plan されるが, heterogeneous manifestation はzyme The amount of raw material is low, and the research period is from ではミュータントの to らなかった. Different species and the same species are now produced, and the new ones are made and planned.