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疾患に関連する蛋白質<翻訳後修飾>の複数同時探索系の確立

疾病相关蛋白多重同步检索系统的建立<翻译后修饰>

基本信息

批准号：
21659150
负责人：
加藤智啓
金额：
$ 2.11万
依托单位：
St. Marianna University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659150/
关键词：
蛋白質翻訳後修飾網羅的解析質量分析電子移動解離(ETD)解析

项目摘要

本研究では、疾患と関連する蛋白質翻訳後修飾を効率よく同定する手段として、多数の蛋白質について複数の翻訳後修飾の同時複数探索系を確立することを目的としている。そのためのステップとして、まず翻訳後修飾としてリン酸化、およびアセチル化に焦点を当て、ヒトの細胞からこれら翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討・評価した。具体的には、ヒト滑膜肉腫細胞株SW982細胞の抽出蛋白質を用い、リン酸化蛋白質、もしくはアセチル化蛋白質に対する抗体アフィニティーカラムによって、これら翻訳後修飾を受けた蛋白質の精製を試みた。その結果、2.6mgの細胞抽出蛋白質から108μgのリン酸化蛋白質が、256μgの細胞抽出蛋白質から4.9μgのアセチル化蛋白質が回収され、これらの組み合わせにより両翻訳後修飾の同時評価が可能と考えられた。本年度、さらにLC-MS/MSを用いてカラム溶出画分中の蛋白質を同定することに加えて、従来の検出方法である電気泳動とそれに続くリン酸化検出蛍光色素もしくはアセチル化リジン抗体を用いた検出方法により、リン酸化蛋白質もしくはアセチル化蛋白質が抗体アフィニティーカラムによって十分精製されていることを検証した。その結果、リン酸化蛋白質画分からは多数のリン酸化蛋白質を示すバンドが検出された。アセチル化蛋白質の画分からは、数本のアセチル化蛋白質を示すバンドが検出された。また、蛋白質がリン酸化とアセチル化を同時に受けていることを示すバンドも、数本検出された。以上より、ヒトの細胞からリン酸化、アセチル化を受けた蛋白質が効率的に精製可能であることが示された。また、LC-MS/MSにおいても同様の結果が得られていることから、精製後、電気泳動を用いずに、LC-MS/MSのみで各翻訳後修飾蛋白質を検出することが可能であることが示された。今後、リン酸化、アセチル化以外の翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討し、最終的に10個以上の翻訳後修飾の同時検出技術の確立したい。

The purpose of this study is to determine the relationship between disease and protein post-translational modification, the efficiency of protein translation, and the methods and methods used in this study. Protein について plural の translation post-modification の simultaneous plural exploration system することを purpose としている.そのためのステップとして, まずturned訳后modification, としてリンacidification, およびアセチル化にfocusをWhen て, ヒトの cells are translated and modified, the けた protein is refined and the する method is used to discuss and evaluate 価した. Specifically, the extraction of proteins from the SW982 synovial sarcoma cell line SW982 cells, the use of い, リン acidified proteins, and the use of もしくはアセチルThe protein に対するantibody アフィニティーカラムによって, これらtranslation and then modified をaccepted けたprotein のpurificationをtestみた.その results, 2.6mg of cell-extracted protein, 108μg of のリン acidified protein, 256μg of cell-extracted protein, 4 .9μg of のアセチル化proteinがrecoveryされ、これらの组み合わせにより両After translation and modification, the possibility of testing and testing was evaluated at the same time. This year, the protein in the LC-MS/MS was determined using the いてカラム dissolution method.に加えて、従来の検出 Method であるElectrophoresis とそれに続くリンAcidified 検出荜光色もしくThe はアセチルリジン antibody を uses the いた検により, リン acidified protein もしくはアセチルThe protein-based anti-antibodies are very refined and highly refined.その Results, リン acidified protein draw points からは Most of the のリン acidified protein をshows すバンドが検出された.アセチル化proteinの画分からは, sukumoto のアセチル化protein をshow すバンドが検出された.また, protein acidification とアセチル化をsimultaneously received けていることをshow すバンドも, several 検出された. The above より, ヒトのcell からリン acidification, アセチル化を are subject to the にたprotein が purification efficiency and can be shown であることがされた.また、LC-MS/MSにおいても同様のRESULTS られていることから、After purification, electrophoresis is used.ずに, LC-MS/MS のみで Each translation of the modified protein を検出することがpossible であることがshows された. From now on, post-translation modifications other than rinic acidification and agarization will be carried out and protein purification methods will be established, and the final post-translation modification technology of more than 10 will be established at the same time.