ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルの構造生物学的研究

线粒体内膜易位通道的结构生物学研究

基本信息

批准号：
14J00404
负责人：
小島理恵子
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Yamagata University (2015-2016)Nagoya University (2014)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J00404/
关键词：
ミトコンドリアカルジオリピントランスロケータ

项目摘要

ミトコンドリア内膜トランスロケータチャネルであるTIM23複合体のメンテナンスを担い，ミトコンドリア内でのカルジオリピン(CL)合成の最初の反応を触媒するTam41の結晶構造解析について，前年度に引き続き，様々なコンストラクトの発現・精製を検討した。今年度は，大腸菌発現系を用いて不溶性画分からのリフォールディング条件を検討した結果，Kluyveromyces lactisおよびKluyveromyces marxianus由来のTam41について，n-Dodecyl-β-D-maltosideとアルギニンの存在下で効率良く巻き戻ることが分かった。両者はゲルろ過クロマトグラフィーにおいても良好な溶出ピークが得られており，その溶出位置から，Tam41は単量体ではなく多量体を形成していることが考えられる。今後，リフォールディングしたTam41が酵素活性（CDP-DAG合成活性）を持っているかを確認し，結晶化スクリーニングに供する予定である。また，前年度までに得られていたPgs1 (PGP合成酵素)やGep4 (PGPホスファターゼ)について，昨年度までに得られた微結晶について結晶化条件の最適化を試みたが，結晶が成長しないため，引き続き沈殿剤の濃度やpH，コンストラクトの長さや基質の有無による結晶化条件の最適化を行う予定である。また，ミトコンドリア外膜と小胞体膜を物理的に結合させるERMES複合体について，前年度までに得られていたMmm1欠損株の増殖阻害を回復させるマルチコピーサプレッサー遺伝子について論文を執筆し，FEBS Letters誌に発表した。さらに，ERMES複合体が小胞体からミトコンドリアへのホスファチジルセリンの輸送に直接的に関与していることを明らかにし，その成果をScientific Reports誌に発表した。

上一年之后，我们研究了TAM41的晶体结构分析的各种构建体的表达和纯化，该晶体结构分析催化了线粒体中心脂蛋白（CL）合成的初始反应，该反应负责维持Tim23复合物，即线粒体内膜转换通道和CL）合成的初始反应。今年，我们使用大肠杆菌表达系统调查了不溶性部分的重折叠条件，并发现在N-Dododecyl-β-d-maltoside and Inchinine和精氨酸和精氨酸和精氨酸的情况下，有效地恢复了源自乳酸乳酸菌和kluyveromyces的TAM41。这两个结果还表现出凝胶过滤色谱法的良好洗脱峰，从洗脱位置，人们认为TAM41形成多聚体而不是单体。将来，我们将检查重折叠的TAM41是否具有酶活性（CDP-DAG合成活性），并将其用于结晶筛选。 Furthermore, we have attempted to optimize the crystallization conditions for the microcrystals obtained up to last year for Pgs1 (PGP synthase) and Gep4 (PGP phosphatase), which were obtained up to the previous year, but as the crystals do not grow, we plan to continue to optimize the crystallization conditions based on the concentration of the precipitant, pH, length of the construct, and whether or not the substrate is present.此外，他撰写了一篇关于Ermes复合体的论文，该论文在物理上结合了线粒体外膜和内质网膜，该膜恢复了上一年获得的MMM1缺陷菌株的生长抑制，并以FEBS字母发表了它。此外，据透露，Ermes复合物直接参与了磷脂酰丝氨酸从内质网的运输，并在科学报告中发表了结果。