Ｄａｘ１を介したＥＳ細胞の自己複製維持機構の解析

マウスES細胞において、核内受容体Dax1はOct3/4を中心とする転写因子ネットワークに属しており、自己複製維持において何等かの役割を果たしていると考えられる。本研究ではES細胞におけるDax1を介した自己複製維持機構の解析を行った。4HT添加によってDax1遺伝子をノックアウトできるコンディショナルノックアウトES細胞株を樹立し、遺伝子発現を確認したところ、ノックアウト２日では分化マーカーの遺伝子変化は見られなかったが、ノックアウト７日の細胞では内胚葉系マーカーであるGata6とTの発現の上昇が見られた。申請者は以前、EsrrbとDax1の相互作用を阻害すると内胚葉系マーカー遺伝子の上昇を確認しているため、Dax1のノックアウト時のGata6の発現上昇もEsrrbが何らかの関与をしていると考え、EsrrbのGata6の発現に対する作用を検証した。Gata6のプロモーター領域を用いてLuciferaseレポーターアッセイやChIPアッセイを行ったところ、EsrrbはGata6のプロモーター上にあるEsrrb結合配列に直接結合し、Gata6プロモーターの転写活性を上昇させていることが明らかになった。また、ES細胞において、Esrrbはco-activatorであるNcoa3と相互作用することが知られているため、Gata6プロモーターに対するNcoa3の作用を検証したところ、Ncoa3によってもGata6のプロモーター活性が上昇することが明らかとなった。このNcoa3によるGata6プロモーター活性の上昇は、Esrrbに結合できないDax1の変異体で抑制されたため、Dax1とNcoa3の相互作用を確認したところ、Dax1とNcoa3は直接結合できることが明らかとなった。以上のことから、Dax1はEsrrbだけではなく、Esrrbのco-activatorであるNcoa3も抑制することによってGata6プロモーターの活性を抑制することによりES細胞の自己複製維持に貢献していることが明らかになった。

マウスES細胞において、核内受容体Dax1はOct3/4を中心とする転写因子ネットワークに属しており、自己複製維持において何等かの役割を果たしていると考えられる。本研究ではES細胞におけるDax1を介した自己複製維持機構の解析を行った。4HT添加によってDax1遺伝子をノックアウトできるコンディショナルノックアウトES細胞株を樹立し、遺伝子発現を確認したところ、ノックアウト２日では分化マーカーの遺伝子変化は見られなかったが、ノックアウト７日の細胞では内胚葉系マーカーであるGata6とTの発現の上昇が見られた。申請者は以前、EsrrbとDax1の相互作用を阻害すると内胚葉系マーカー遺伝子の上昇を確認しているため、Dax1のノックアウト時のGata6の発現上昇もEsrrbが何らかの関与をしていると考え、EsrrbのGata6の発現に対する作用を検証した。Gata6のプロモーター領域を用いてLuciferaseレポーターアッセイやChIPアッセイを行ったところ、EsrrbはGata6のプロモーター上にあるEsrrb結合配列に直接結合し、Gata6プロモーターの転写活性を上昇させていることが明らかになった。また、ES細胞において、Esrrbはco-activatorであるNcoa3と相互作用することが知られているため、Gata6プロモーターに対するNcoa3の作用を検証したところ、Ncoa3によってもGata6のプロモーター活性が上昇することが明らかとなった。このNcoa3によるGata6プロモーター活性の上昇は、Esrrbに結合できないDax1の変異体で抑制されたため、Dax1とNcoa3の相互作用を確認したところ、Dax1とNcoa3は直接結合できることが明らかとなった。以上のことから、Dax1はEsrrbだけではなく、Esrrbのco-activatorであるNcoa3も抑制することによってGata6プロモーターの活性を抑制することによりES細胞の自己複製維持に貢献していることが明らかになった。