マウス精巣性テラトーマ形成に関わる新規原因遺伝子の同定

本研究の目的は、マウスの精巣に発症する始原生殖細胞を起源としたテラトーマ形成の原因遺伝子の同定である。昨年度までに私は胎仔精巣を移植することによりテラトーマ（ETT）の形成を誘発する原因遺伝子が存在する領域ett1, ett2とett3を同定している。精巣生テラトーマ形成系統と非形成系統のマウスを用いエクソームシークエンス解析を行い、この3領域に変異遺伝子が存在していることを明らかにした。本年度はett1領域に存在している変異遺伝子Mc4rについて原因遺伝子であるか検証するためにゲノム編集 (ノックイン) マウスの作出を行った。遺伝子改変技術としてはCRISPR/Cas9システムを用いた。候補遺伝子Mc4rに対し、2つのgRNAとCas9タンパク質と変異型配列を持つシングルストランドオリゴデオキシリヌクレオチド（ssODN）を設計し野生型系統への変異型配列のノックインを試みた。受精卵への導入方法としてはエレクトロポレーターを用いたTAKE（Technique for Animal Knockout system by Electroporation）法を用いた。これまでに110個の2細胞期胚を移植し、13匹の産仔を得ることができた。その得られた13匹の産仔のうち10匹でゲノムに変異を導入することが出来た（76.9％）。得られた産仔のほとんどが2つのgRNAに挟まれた領域に塩基の挿入欠損によるアミノ酸の置換やストップコドン獲得などの変異が導入されていたが、目的の変異のノックイン（KI）マウスも得ることが出来た（20％）。Mc4rがett1の原因遺伝子であるか検証するため、ノックアウト（KO）マウスの交配を行った。野生型の胎仔精巣を移植したものは成体精巣内で胎仔精巣由来の精細管が分化し精子形成が進行していたが、KO型の胎仔精巣を野生型系統成体精巣に移植したものは成体精巣内でケラチンパールを形成していた。この移植実験によりETT様の組織を形成したことから、Mc4rがテラトーマ形成の原因遺伝子である可能性が強く示唆された。

本研究の目的は、マウスの精巣に発症する始原生殖細胞を起源としたテラトーマ形成の原因遺伝子の同定である。昨年度までに私は胎仔精巣を移植することによりテラトーマ（ETT）の形成を誘発する原因遺伝子が存在する領域ett1, ett2とett3を同定している。精巣生テラトーマ形成系統と非形成系統のマウスを用いエクソームシークエンス解析を行い、この3領域に変異遺伝子が存在していることを明らかにした。本年度はett1領域に存在している変異遺伝子Mc4rについて原因遺伝子であるか検証するためにゲノム編集 (ノックイン) マウスの作出を行った。遺伝子改変技術としてはCRISPR/Cas9システムを用いた。候補遺伝子Mc4rに対し、2つのgRNAとCas9タンパク質と変異型配列を持つシングルストランドオリゴデオキシリヌクレオチド（ssODN）を設計し野生型系統への変異型配列のノックインを試みた。受精卵への導入方法としてはエレクトロポレーターを用いたTAKE（Technique for Animal Knockout system by Electroporation）法を用いた。これまでに110個の2細胞期胚を移植し、13匹の産仔を得ることができた。その得られた13匹の産仔のうち10匹でゲノムに変異を導入することが出来た（76.9％）。得られた産仔のほとんどが2つのgRNAに挟まれた領域に塩基の挿入欠損によるアミノ酸の置換やストップコドン獲得などの変異が導入されていたが、目的の変異のノックイン（KI）マウスも得ることが出来た（20％）。Mc4rがett1の原因遺伝子であるか検証するため、ノックアウト（KO）マウスの交配を行った。野生型の胎仔精巣を移植したものは成体精巣内で胎仔精巣由来の精細管が分化し精子形成が進行していたが、KO型の胎仔精巣を野生型系統成体精巣に移植したものは成体精巣内でケラチンパールを形成していた。この移植実験によりETT様の組織を形成したことから、Mc4rがテラトーマ形成の原因遺伝子である可能性が強く示唆された。