ミトコンドリア内膜トランスロケータＴＩＭ２３とＴＩＭ２２複合体の構造生物学的解析

本年度は，Msp1とCdc48という２つのAAA-ATPアーゼの役割分担とDoa10による基質のユビキチン化とMsp1およびCdc48による膜引き抜きのどちらが先に起こるステップなのかを決定し，ミスターゲットTAタンパク質の分解機構の全容解明を目指した．まず，野生型酵母において，Msp1の基質のユビキチン化が細胞内のどこで起こるのかを調べた．細胞抽出液をミトコンドリア画分とサイトゾルに分画し，それぞれの画分から基質のユビキチン化を調べたところ，ユビキチン化基質はミトコンドリア画分とサイトゾルの両方に検出された．次に，msp1欠損株において，基質のユビキチン化を調べたところ，基質のユビキチン化はミトコンドリア画分とサイトゾル画分の両方に検出されたが，野生型酵母と比べて，ユビキチン化の効率が大きく低下することがわかった．一方，cdc48温度感受性株を用いて，基質のユビキチン化を調べたところ，ポリユビキチン化された基質はミトコンドリア膜に蓄積することがわかった．共免疫沈降実験によって，Msp1とCdc48のユビキチン化状態に応じた基質との結合を調べたところ，Msp1は非ユビキチン化基質と結合するが，ポリユビキチン化基質との結合は確認できなかった．一方で，Cdc48は非ユビキチン化とポリユビキチン化基質の両方と結合することがわかった．さらに，msp1欠損株を用いて，Cdc48と基質の結合を調べたところ，Cdc48と結合するポリユビキチン化基質の量が大きく減少した．このことから，Msp1は，Doa10による基質のユビキチン化を促進する因子であり，ポリユビキチン化基質をミトコンドリア膜から引き抜くためには，Cdc48が重要であることが示唆された．以上の結果をもとに，申請者は，ミスターゲットTAタンパク質の分解モデルを提唱した．

本年度は，Msp1とCdc48という２つのAAA-ATPアーゼの役割分担とDoa10による基質のユビキチン化とMsp1およびCdc48による膜引き抜きのどちらが先に起こるステップなのかを決定し，ミスターゲットTAタンパク質の分解機構の全容解明を目指した．まず，野生型酵母において，Msp1の基質のユビキチン化が細胞内のどこで起こるのかを調べた．細胞抽出液をミトコンドリア画分とサイトゾルに分画し，それぞれの画分から基質のユビキチン化を調べたところ，ユビキチン化基質はミトコンドリア画分とサイトゾルの両方に検出された．次に，msp1欠損株において，基質のユビキチン化を調べたところ，基質のユビキチン化はミトコンドリア画分とサイトゾル画分の両方に検出されたが，野生型酵母と比べて，ユビキチン化の効率が大きく低下することがわかった．一方，cdc48温度感受性株を用いて，基質のユビキチン化を調べたところ，ポリユビキチン化された基質はミトコンドリア膜に蓄積することがわかった．共免疫沈降実験によって，Msp1とCdc48のユビキチン化状態に応じた基質との結合を調べたところ，Msp1は非ユビキチン化基質と結合するが，ポリユビキチン化基質との結合は確認できなかった．一方で，Cdc48は非ユビキチン化とポリユビキチン化基質の両方と結合することがわかった．さらに，msp1欠損株を用いて，Cdc48と基質の結合を調べたところ，Cdc48と結合するポリユビキチン化基質の量が大きく減少した．このことから，Msp1は，Doa10による基質のユビキチン化を促進する因子であり，ポリユビキチン化基質をミトコンドリア膜から引き抜くためには，Cdc48が重要であることが示唆された．以上の結果をもとに，申請者は，ミスターゲットTAタンパク質の分解モデルを提唱した．