Molecular Design of Streptavidin Mutant with specificity for artificial biotin derivatives

具有人工生物素衍生物特异性的链霉亲和素突变体的分子设计

基本信息

批准号：
18F18765
负责人：
井上豪
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-11-09 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ビオチン-ストレプトアビジンは生物界で最も結合定数の高い組み合わせであり、この組み合わせを用いたStrep-tagとして知られている蛋白質の発現・精製システムが開発されている。８つのアミノ酸からなるタグペプチドを認識するストレプトアビジンを担持したビーズで目的タンパク質を高純度に精製することができるシステムである。しかし、生体内にはビオチンがビタミンとして存在しており、ビタミンが存在する系では精製システムも不活化され、ビーズに担持したストレプトアビジンが機能を失うケースが想定される。そこで本研究では天然型ビオチンに干渉されない新規なタグ精製システムの構築を目指した。これまでに我々はストレプトアビジンの活性部位の４カ所に変異を加えると天然型ビオチンに全く結合せず、非天然型ビオチンにのみ結合する変異型ストレプトアビジンの作製に成功していたが、そのノウハウを生かし、まず8つのアミノ酸からなるタグペプチドとD27G/L110E、D27G/S112Y、D27G/S112Fの変異体との複合体のⅩ線構造解析を試み、それぞれ1.30、1.43、1.40Å分解能の精度で解析した。ペプチドとの間の結合定数は、4.51×10-7M (S27G), 4.15×10-6 M (S27G/L110E), 2.45×10-6 M（S27G/S112Y）, 1.31×10-6M (V2112 D27A）となり、野生型Wild SAの値6.91×10-7Mの値とほぼ変わらなかった。得られた構造を基にさらに構造機能相関を検討し、１つの変異体で天然型ビオチンには結合せず、タグペプチドにのみ結合する変異体ストレプトアビジンを作製することに成功した。これによってビタミンとして存在するビオチンに阻害されない新規なタグ精製システムを構築することができた。

生物素 - 链霉亲和素是生物学世界中最高结合常数的组合，并且使用这种组合开发了一种称为链球菌标记的蛋白质的表达和纯化系统。这是一个允许携带链霉亲和蛋白的珠将靶蛋白纯化至高纯度的系统，该珠识别由八个氨基酸组成的TAG肽。然而，生物素作为维生素存在于体内，并且在存在维生素的系统中，纯化系统被灭活，并且假定链霉亲和蛋白携带在珠子上的链霉亲和素会失去其功能。因此，这项研究旨在创建一个新的标签纯化系统，不会干扰天然生物素。到目前为止，当在链霉亲和蛋白的活性部位的四个位置进行突变时，我们已经成功地创建了一种突变链霉亲和素，该突变型链霉亲和素完全与天然生物素结合，但仅与非天然生物素结合。使用此知识，我们首先尝试分析由八个氨基酸和突变体D27G/L110E，D27G/S112Y和D27G/S112F组成的TAG肽的X线结构，并分别以1.30、1.43、1.43和1.40Å分析的精度分析。肽之间的结合常数为4.51×10-7m（S27G），4.15×10-6M（S27G/L110E），2.45×10-6M（S27G/S112Y），和1.31×10-6m（V2112 D27A），几乎是狂野的10-10-10-10-10-10-11次相同。基于获得的结构，我们进一步研究了结构功能相关性，并成功产生了一种变异链霉亲和素，该变异蛋白不与天然生物素结合，而仅与一个突变体中的标记肽结合。这允许构建一种新型的标签纯化系统，该系统并未被生物素抑制，而生物素却被抑制为维生素。