Characterization of the unique Fe-S-O metallocluster of HCP enzyme

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2022年度では、HCPの触媒機構解明に必要不可欠となる、高分解能X線結晶構造を与えるHCPの探索を行った。様々な嫌気性微生物由来のHCPを、His-tagを持つ大腸菌組換え酵素として発現するためのプラスミドをそれぞれ構築し、嫌気的に発現、精製、結晶化を行った。その結果、異なる３種の微生物由来のHCPの結晶が得られた。放射光施設Photon factory、Swiss Light Source、SPring-8などでそれらのX線結晶回折データを収集し、XDSによるデータ処理、Molrepを用いた分子置換法による位相決定とCootによる構造モデリング、Refmac5による構造精密化を行なった。構造決定したHCPのうち、ある1つの微生物種由来のHCPが、その活性部位の特徴的な無機クラスターの原子座標、ならびに、その構成元素の種類を判別可能な高分解能で構造決定された。この構造では、活性部位のhybrid clusterが、以前に報告された[4Fe-2S-3O]型の休止状態のクラスターであること、そして、その配位子となるアミノ酸が同じ位置に高度に保存されていることが明らかとなった。また、配位子の1つのシステインは、システインペルスルフィドの形をとっており、これも以前のHCPの休止状態の結晶構造での報告例と一致した。これまでの報告例にあるHCPは全て本来の宿主由来のnativeタンパク質、または同種生物由来組み換え体発現系を用いているが、今回の実験で、異種生物由来のHCPを大腸菌で大量に得る系を確立できた。