Characterization of the unique Fe-S-O metallocluster of HCP enzyme

HCP 酶独特的 Fe-S-O 金属簇的表征

• 批准号: 22K05137
• 负责人: 藤城 貴史
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05137/
• 关键词: HCP; 鉄-硫黄クラスター; 鉄-硫黄-酸素クラスター; X線結晶構造解析; 反応中間体; 触媒機構; 還元; Hybrid cluster protein; 金属クラスター

2022年度では、HCPの触媒機構解明に必要不可欠となる、高分解能X線結晶構造を与えるHCPの探索を行った。様々な嫌気性微生物由来のHCPを、His-tagを持つ大腸菌組換え酵素として発現するためのプラスミドをそれぞれ構築し、嫌気的に発現、精製、結晶化を行った。その結果、異なる３種の微生物由来のHCPの結晶が得られた。放射光施設Photon factory、Swiss Light Source、SPring-8などでそれらのX線結晶回折データを収集し、XDSによるデータ処理、Molrepを用いた分子置換法による位相決定とCootによる構造モデリング、Refmac5による構造精密化を行なった。構造決定したHCPのうち、ある1つの微生物種由来のHCPが、その活性部位の特徴的な無機クラスターの原子座標、ならびに、その構成元素の種類を判別可能な高分解能で構造決定された。この構造では、活性部位のhybrid clusterが、以前に報告された[4Fe-2S-3O]型の休止状態のクラスターであること、そして、その配位子となるアミノ酸が同じ位置に高度に保存されていることが明らかとなった。また、配位子の1つのシステインは、システインペルスルフィドの形をとっており、これも以前のHCPの休止状態の結晶構造での報告例と一致した。これまでの報告例にあるHCPは全て本来の宿主由来のnativeタンパク質、または同種生物由来組み換え体発現系を用いているが、今回の実験で、異種生物由来のHCPを大腸菌で大量に得る系を確立できた。

In 2022, the discovery of HCP catalyst mechanism is necessary, and X-ray crystal structure with high decomposition energy is explored. HCP, His-tag, Escherichia coli, enzyme development, construction, development, purification and crystallization of microorganisms The results showed that HCP crystals were obtained from three kinds of microorganisms. Photon factory, Swiss Light Source, SPring-8, etc., X-ray crystallography, XDS, etc., molecular displacement method, phase determination, structure refinement, etc. Structural determination of HCP, characteristics of active sites, atomic coordinates, and types of constituent elements can be determined by high decomposition energy. The structure of the active site of the hybrid cluster, previously reported in the [4Fe-2S-3O] type of rest state of the ligand, the acid, the same position, highly preserved. The crystal structure of the ligand is consistent with that of the previous HCP at rest. In this report, HCP was found to have completely transformed the native origin of the host organism, and the native origin of the same organism was found to have transformed the host organism into a host organism.

项目成果

Structural Analysis of Class II Hybrid Cluster Protein (HCP) from Escherichia coli

大肠杆菌 II 类杂合簇蛋白 (HCP) 的结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: H. Miyake;T. Nakakoji;H. Sato;D. Ono;E. Mieda;S. Shinoda;H. Tsukube;H. Kawasaki;R. Arakawa;M. Shizuma;Takashi Fujishiro
• 通讯作者: Takashi Fujishiro