Target identification of proteins and small molecules using the fission yeast ORFeome

タンパク質は主に他のタンパク質と物理的に相互作用することによって機能し、相互作用の変化はタンパク質の機能および病状等の変化を引き起こす。特定のタンパク質の機能を解析するにあたり、それがどのようなタンパク質と相互作用するのかを明らかにすることは非常に重要であることから、これまで、出芽酵母の2-ハイブリッドシステムや、プルダウンとLC-MSを組み合わせた生化学的な方法など、様々な方法が開発されてきたが、どの方法にも一長一短があり、新たな解析法を開発し、解析手段の選択肢を増やすことは重要である。そこで本研究では、タンパク質－タンパク質間相互作用を解析するための方法として、近年注目されているNanoBiT発光補完法を、分裂酵母の全遺伝子ライブラリーと組み合わせることで、タンパク質の相互作用相手を網羅的にスクリーニングする実験系を開発することを目指した。初年度は、本スクリーニング系を分裂酵母で構築するために、分裂酵母株および発現ベクターの開発を中心に行った。本実験系は深海エビのルシフェラーゼを改変したLgBiT断片と、それに低親和性で結合して機能するSmBiTペプチドとのスプリット系であるため、それぞれをORFと融合可能で、かつ、分裂酵母の染色体に挿入できるようなベクターを開発した。さらにこのような実験系で常に問題となる、タグ融合時における立体障害等の問題を可能な限り回避できるように、遺伝子をLgBiTと融合させる際にORFの5'末端にLgBiTを融合させるタイプの発現ベクターと、3'末端に融合させるタイプのベクターを別々に用意し、これらを同時に１つの株に発現できるようにした。また、これらのベクターを染色体に挿入して融合タンパク質を発現できるように、CRISPR/Cas9のシステムを用い、lys1およびarg3遺伝子のORF内に変異を有する株を作製した。

タンパク質は主に他のタンパク質と物理的に相互作用することによって機能し、相互作用の変化はタンパク質の機能および病状等の変化を引き起こす。特定のタンパク質の機能を解析するにあたり、それがどのようなタンパク質と相互作用するのかを明らかにすることは非常に重要であることから、これまで、出芽酵母の2-ハイブリッドシステムや、プルダウンとLC-MSを組み合わせた生化学的な方法など、様々な方法が開発されてきたが、どの方法にも一長一短があり、新たな解析法を開発し、解析手段の選択肢を増やすことは重要である。そこで本研究では、タンパク質－タンパク質間相互作用を解析するための方法として、近年注目されているNanoBiT発光補完法を、分裂酵母の全遺伝子ライブラリーと組み合わせることで、タンパク質の相互作用相手を網羅的にスクリーニングする実験系を開発することを目指した。初年度は、本スクリーニング系を分裂酵母で構築するために、分裂酵母株および発現ベクターの開発を中心に行った。本実験系は深海エビのルシフェラーゼを改変したLgBiT断片と、それに低親和性で結合して機能するSmBiTペプチドとのスプリット系であるため、それぞれをORFと融合可能で、かつ、分裂酵母の染色体に挿入できるようなベクターを開発した。さらにこのような実験系で常に問題となる、タグ融合時における立体障害等の問題を可能な限り回避できるように、遺伝子をLgBiTと融合させる際にORFの5'末端にLgBiTを融合させるタイプの発現ベクターと、3'末端に融合させるタイプのベクターを別々に用意し、これらを同時に１つの株に発現できるようにした。また、これらのベクターを染色体に挿入して融合タンパク質を発現できるように、CRISPR/Cas9のシステムを用い、lys1およびarg3遺伝子のORF内に変異を有する株を作製した。