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2種類のアポトーシス抑制性生理活性物質のcDNAクローニング

两类凋亡抑制生理活性物质的cDNA克隆

基本信息

批准号：
10877261
负责人：
本田謙一
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877261/
关键词：
アポトーシスサイトカイン受容体卵巣癌

项目摘要

【研究目的】我々は2種類の癌細胞培養上清に強力なアポトーシス阻害活性の存在を発見し、これらのアポトーシス抑制分子の精製およびそのcDNAクローニングを目的として研究を行ってきた。【研究成果】(1)ある種のマウス白血病細胞培養上清に放射線誘発アポトーシスおよびFas介在アポトーシスを強力に抑制する活性を1995年に発見したことから、まずアポトーシス抑制活性を指標に細胞培養上清から抑制分子の精製を試みた。極めて不安定な物質であり、低温操作と、20%Glycerol含有緩衝液を用いた精製を試みたが、高次構造あるいはオリゴマー構造のためか精製途中で活性が消失するという結果に終わった。次にこのアポトーシス抑制分子に対するモノクローナル抗体作製を計画したが、免疫ラット血清には中和抗体活性が検出されなかった。cDNAへ発現クローニング法についてはアポトーシス抑制分子分泌細胞株の特許権問題があるために、代用細胞として白血病細胞株を20種類近くスクリー二ングしたが、同様のアポトーシス抑制活性は検出できなかった。現在の所、このアポトーシス抑制活性物質については、分子レベルでの追求を中止しており、これまでの研究の途中経過を論文に執筆している。(2)研究分担者のひとりである田中が発見したアポトーシス現象(田中の樹立したマウス白血病細胞が酸化ストレスによリアポトーシスに陥る:Tanaka et al., Eur J Immunol.1994)を強く抑制する活性を、ヒト卵巣癌およびヒト子宮癌細胞株培養上清に認めたことがきっかけである。(1)これまでの諸実験から、本分子は分子量が比較的小さい未知のサイトカインであると予測し、まず直接的なcDNA発現クローニング法を試みた。分泌細胞mRNA由来pCDM8cDNA libraryを作製し、COS7にトランスフェクションし、その培養上清のアポトーシス抑制能を指標にスクリーニングした。5回スクリーニング後に、約200クローンを個別に検討したが、目的とする活性分子は見つからなかった。(2)当初、粗精製アポトーシス抑制分子でマウスを免疫しモノクローナル抗体の作製を試みたが、マウス血清中には中和活性が見い出せなかった。現在は、高純度精製分子を用いてハイブリドーマ樹立を再度試みている。分子クローニングが未成功であるためにまだ予定した論文は完成していないが、現在までに判明した細胞生物学的諸性質を論文にまとめている。

[Objective] To detect the existence of potent anti-tumor activity in culture supernatant of two kinds of cancer cells, and to purify anti-tumor inhibitor molecules and cDNA fragments. [Results of research](1) The activity of radiation-induced apoptosis and Fas mediator in leukemia cell culture supernatant was strongly inhibited by Fas mediator, which was discovered in 1995, and the purification of inhibitory molecules in cell culture supernatant was tested. Extremely unstable substances, low temperature operation, 20% Glycerol containing buffer solution, purification, high order structure, structure, purification, activity, disappearance, results In addition, the immune system may be used to detect the activity of neutralizing antibodies. The cDNA discovery method is used to detect the inhibitory activity of different kinds of leukemic cell lines. Now, the research on the inhibition of active substances in the molecular cycle has been completed. (2)Tanaka et al., Eur J Immunol.1994) strongly inhibits the activity of human ovarian cancer and uterine cancer cell line culture supernatant. (1)The molecular weight of this molecule is relatively small and unknown, and the direct cDNA discovery method is tried. Secreting cell mRNA is derived from pCDM8 cDNA library, COS7 gene expression, and cell culture supernatant inhibition index. 5 times after the release, about 200 times after the individual search, the purpose of the active molecules to see the release (2)In the first place, crude purification of anti-virus molecules, anti-virus antibody production, anti-virus serum neutralization activity Now, try again to refine molecules with high purity. Molecular biology has not been successful, but now it has been determined that the properties of cell biology have been determined.