ヒストンの受け渡し活性測定系の開発から探索するヒストンリサイクルの分子機構

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DNA複製に伴い、鋳型鎖ヒストンを新生鎖で再利用するヒストンリサイクルが行われる。本研究ではヒストンリサイクルの生化学的再構築を目指す。とりわけ、（１）鋳型鎖からヒストンを受け取って保持し、（２）そのヒストンを新生鎖のヌクレオソーム形成に供する、という二つのステップを各々測定するアッセイ系を開発することを目指す。まず、ヒストンシャペロンと考えられている複製ヘリカーゼ複合体のサブユニットMcm2のN末端領域（ここではMcm2Nとよぶ）を、任意のDNA領域に固定する手法の確立を目指した。いくつかの方法を試した結果、最終的に、Mcm2NをLexAとの融合タンパク質として精製して、SOS-Box領域をもつDNAと結合させることで、安定に領域特異的なDNA-Mcm2N結合を確立した。来年度以降は、この系を用いて、Mcm2Nを固定したDNA領域周辺に対するヒストンローディング（すなわちヌクレオソーム形成）について、検討する。Mcm2Nは複製フォークの進行の方向において、もっとも前方に位置するため、解離した鋳型鎖ヌクレオソームから放出されたヒストンに最も初期にアクセスすると考えられる。Mcm2Nが捕捉したヒストンは、より新生鎖に近接する複製フォーク後方の因子に受け渡され、最終的に新生鎖に結合すると考える。したがって、Mcm2Nが結合したヒストンタンパク質をどの因子に受け渡すか、生化学的な競合実験で試した。Mcm2Nとヒストンとを結合させておき、そこにDpb3-Dpb4などのヒストンシャペロン複製因子を加える実験を行っている。これまでに、加える因子依存的に、Mcm2Nとヒストンとの結合が促進／阻害される様子が予備的に検出されているため、来年度以降、さらに詳細な解析を進める。