Development of novel drug screening system for neuroblastoma by elucidating the transcriptional activation mechanism of glycosyltransferase

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令和4年度は研究実施計画に基づいて、神経芽腫の悪性形質に関わるβ4-ガラクトース転移酵素 (β4GalT) 3の転写因子N-Mycによる転写活性化の分子メカニズムの解析を実施した。定量的RT-PCRによって、N-MycのmRNA発現はSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫ではA549ヒト肺癌細胞に比べて12倍高いことが示された。そのため共導入実験ではN-Mycの効果がより顕著に現れることを期待して、N-Mycの発現が低いA549細胞を使用することとした。初めに、β4GalT3遺伝子の5’-上流領域に存在する3箇所のN-Myc結合部位のうち、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化には-1148/-1143のN-Myc結合部位が関わっていることを特定した。次に、β4GalT3の転写を制御する転写因子Sp3とN-Mycの相互関係を明らかにするために、Sp3結合部位 (-39/-30と-19/-10) に変異を導入したレポータープラスミドとN-Myc発現プラスミドを共導入することで、N-Mycによるβ4GalT3プロモーターの活性化の有無を解析した。その結果、Sp3結合部位に変異を導入すると、N-Mycを共導入してもプロモーター活性は増加しなかった。従って、N-MycがSp3と共同してβ4GalT3の転写を活性化することが初めて明らかにされた。さらに、β4GalT3の転写活性化にSp3とN-Mycがどのような分子メカニズムで関与するかを明らかにするために、Sp3とN-Mycの相互作用を解析した。SH-SY5Y細胞から調製した核抽出物を試料として抗Sp3抗体を用いた共免疫沈降を行ない、ウエスタンブロット解析によりSp3とN-Mycを検出した。その結果、共免疫沈降物中にSp3が検出されたが、N-Mycは検出されなかった。従って、Sp3とN-Mycは直接相互作用していない可能性が示唆された。