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Development of novel drug screening system for neuroblastoma by elucidating the transcriptional activation mechanism of glycosyltransferase

阐明糖基转移酶转录激活机制，开发神经母细胞瘤新药筛选系统

基本信息

批准号：
22K06593
负责人：
佐藤武史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和4年度は研究実施計画に基づいて、神経芽腫の悪性形質に関わるβ4-ガラクトース転移酵素 (β4GalT) 3の転写因子N-Mycによる転写活性化の分子メカニズムの解析を実施した。定量的RT-PCRによって、N-MycのmRNA発現はSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫ではA549ヒト肺癌細胞に比べて12倍高いことが示された。そのため共導入実験ではN-Mycの効果がより顕著に現れることを期待して、N-Mycの発現が低いA549細胞を使用することとした。初めに、β4GalT3遺伝子の5’-上流領域に存在する3箇所のN-Myc結合部位のうち、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化には-1148/-1143のN-Myc結合部位が関わっていることを特定した。次に、β4GalT3の転写を制御する転写因子Sp3とN-Mycの相互関係を明らかにするために、Sp3結合部位 (-39/-30と-19/-10) に変異を導入したレポータープラスミドとN-Myc発現プラスミドを共導入することで、N-Mycによるβ4GalT3プロモーターの活性化の有無を解析した。その結果、Sp3結合部位に変異を導入すると、N-Mycを共導入してもプロモーター活性は増加しなかった。従って、N-MycがSp3と共同してβ4GalT3の転写を活性化することが初めて明らかにされた。さらに、β4GalT3の転写活性化にSp3とN-Mycがどのような分子メカニズムで関与するかを明らかにするために、Sp3とN-Mycの相互作用を解析した。SH-SY5Y細胞から調製した核抽出物を試料として抗Sp3抗体を用いた共免疫沈降を行ない、ウエスタンブロット解析によりSp3とN-Mycを検出した。その結果、共免疫沈降物中にSp3が検出されたが、N-Mycは検出されなかった。従って、Sp3とN-Mycは直接相互作用していない可能性が示唆された。

In 2010 and 2014, we carried out research on the analysis of β4-glucuronidase (β4GalT) 3 and its transcription factor N-Myc, which are related to the gene expression and molecular activation of neuroblastoma. Quantitative RT-PCR analysis showed that mRNA expression of N-Myc and N-Myc was 12-fold higher in SH-SY5Y cells than in A549 cells. N-Myc is expected to be introduced into A549 cells. There are three N-Myc binding sites in the 5 '-upstream domain of β 4GalT3 gene, and the N-Myc binding sites in β 4GalT3 gene are-1148/-1143. In addition, the relationship between the writing factors Sp3 and N-Myc in the control of β 4GalT3 binding sites (-39/-30 and-19/-10) was analyzed. As a result, the Sp3 binding site was introduced differently, and the N-Myc co-introduction increased the activity of the protein. N-Myc-Sp3 and β4GalT-3 are activated together. The interaction between Sp3 and N-Myc in the activation of β 4GalT3 was analyzed. SH-SY5Y cells were isolated from nuclear extracts by immunizing with anti-Sp3 antibodies. The results showed that Sp3 and N-Myc were detected in co-immune sediments. The possibility of direct interaction between Sp3 and N-Myc is demonstrated.