硫酸化糖鎖に着目した胆管細胞におけるムチンコアタンパク質の機能解析

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本研究の目的は、硫酸化糖鎖で修飾されたムチンコアタンパク質の胆管細胞における機能を明らかにすることである。令和4年度の研究実施計画は、硫酸化糖鎖のコアタンパク質と考えられたムチンXの遺伝子をクローニングして遺伝子発現ベクターを作製すること、さらに細胞株を用いたタンパク質発現解析を行うことであった。当初はムチンX cDNAを複数に分けて遺伝子増幅したのち、それらを連結させることで全長cDNAを入手する予定であった。しかしながら、市販のムチンX遺伝子発現ベクター入手することができたため、このムチンX遺伝子発現ベクターを使用して実験を行うことにした。まず始めに、ムチンX遺伝子発現ベクターに組み込まれたムチンX のオープンリーディングフレーム（ORF）の塩基配列を明らかにするため、シーケンスを用いて塩基配列の同定を行った。その結果、ムチンXのORFの約90%を解読したが、残り約10%の配列は繰り返し配列からなるタンデムリピート構造を含んでいることからプライマーが非特異的に結合し、シーケンスを困難にしている。次いでムチンXタンパク質の発現を確認するため、硫酸化糖鎖を発現するように遺伝子改変した細胞株および改変前の細胞株にムチンX遺伝子発現ベクターを遺伝子導入し、細胞破砕液から調製した総タンパク液と細胞培養上清を用いてウェスタンブロットを行った。ムチンXに結合させたタグに対する抗体でウェスタンブロットを行ったところ、総タンパク液から抗タグ抗体で検出されるバンドが確認されたが、タンパク質発現量が低かったことから、実験の条件の変更を行っている。免疫沈降に関しては、条件検討を重ねている。