硫酸化糖鎖に着目した胆管細胞におけるムチンコアタンパク質の機能解析

胆管细胞粘蛋白核心蛋白的功能分析，重点关注硫酸化糖链

• 批准号: 22K06977
• 负责人: 星野 瞳
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: University of Fukui
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06977/
• 关键词: ムチン; 硫酸化糖鎖; 遺伝子発現ベクター; ウェスタンブロット; 免疫沈降; 肝臓; 糖タンパク質; 肝内胆管; 細胆管反応

本研究の目的は、硫酸化糖鎖で修飾されたムチンコアタンパク質の胆管細胞における機能を明らかにすることである。令和4年度の研究実施計画は、硫酸化糖鎖のコアタンパク質と考えられたムチンXの遺伝子をクローニングして遺伝子発現ベクターを作製すること、さらに細胞株を用いたタンパク質発現解析を行うことであった。当初はムチンX cDNAを複数に分けて遺伝子増幅したのち、それらを連結させることで全長cDNAを入手する予定であった。しかしながら、市販のムチンX遺伝子発現ベクター入手することができたため、このムチンX遺伝子発現ベクターを使用して実験を行うことにした。まず始めに、ムチンX遺伝子発現ベクターに組み込まれたムチンX のオープンリーディングフレーム（ORF）の塩基配列を明らかにするため、シーケンスを用いて塩基配列の同定を行った。その結果、ムチンXのORFの約90%を解読したが、残り約10%の配列は繰り返し配列からなるタンデムリピート構造を含んでいることからプライマーが非特異的に結合し、シーケンスを困難にしている。次いでムチンXタンパク質の発現を確認するため、硫酸化糖鎖を発現するように遺伝子改変した細胞株および改変前の細胞株にムチンX遺伝子発現ベクターを遺伝子導入し、細胞破砕液から調製した総タンパク液と細胞培養上清を用いてウェスタンブロットを行った。ムチンXに結合させたタグに対する抗体でウェスタンブロットを行ったところ、総タンパク液から抗タグ抗体で検出されるバンドが確認されたが、タンパク質発現量が低かったことから、実験の条件の変更を行っている。免疫沈降に関しては、条件検討を重ねている。

这项研究的目的是阐明用胆管细胞中用硫化糖链修饰的粘蛋白核心蛋白的功能。 2022年的研究计划是克隆粘蛋白X的基因，该基因被认为是硫化糖链的核心蛋白，以创建基因表达载体，并使用细胞系进一步分析蛋白质表达。最初，通过将粘蛋白X cDNA分裂为多个cDNA，然后将其连接以获得全长cDNA来扩增基因。但是，由于可获得市售的粘蛋白X基因表达载体，因此我们决定使用此粘蛋白X基因表达载体进行实验。首先，为了阐明粘蛋白X的开放阅读框（ORF）的基本序列，该粘蛋白X集成到粘蛋白X基因表达载体中，使用序列鉴定了碱基序列。结果，将大约90％的粘蛋白X ORF解密，但其余10％的序列包含由重复序列组成的串联重复结构，这导致引物的非特异性结合，从而使测序变得困难。接下来，为了确认粘蛋白X蛋白的表达，将粘蛋白X基因表达载体转移到经过遗传修饰的细胞系中，以表达硫酸化的糖链和细胞线，并使用从细胞液压溶液和细胞溶液和细胞培养物中制备的总蛋白质溶液进行蛋白质印迹。当用与粘蛋白X结合的TAG的抗体进行蛋白质印迹时，在总蛋白质溶液中证实了由抗TAG抗体检测到的条带，但蛋白质表达水平较低，因此实验的条件更改了。关于免疫沉淀，正在反复检查条件。

项目成果

Establishment of human ovarian cancer-derived cell lines

人卵巢癌来源细胞系的建立

• 发表时间: 2022
• 作者: Hitomi Hoshino;Daisuke Inoue;Tomoya O Akama;Motohiro Kobayashi
• 通讯作者: Motohiro Kobayashi

Distinct sulfated glycans expressed in intrahepatic cholangiocarcinoma: a potential target for new therapy

• DOI: 10.2217/imt-2022-0220
• 发表时间: 2023-02-15
• 期刊: IMMUNOTHERAPY
• 影响因子: 2.8
• 作者: Hoshino，Hitomi;Kobayashi，Motohiro
• 通讯作者: Kobayashi，Motohiro

Expression and Clinical Significance of Spi-B in B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia

Spi-B在B细胞急性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义

• DOI: 10.1369/00221554221130383
• 发表时间: 2022
• 期刊: J Histochem Cytochem
• 影响因子: 3.2
• 作者: Yuzuru Ariga;Shulin Low;Hitomi Hoshino;Tsutomu Nakada;Tomoya O Akama;Akifumi Muramoto;Mana Fukushima;Takahiro Yamauchi;Yusei Ohshima;Motohiro Kobayashi
• 通讯作者: Motohiro Kobayashi

Sulfated Glycans Recognized by S1 Monoclonal Antibody can Serve as a Diagnostic Marker for Malignant Pleural Mesothelioma

S1 单克隆抗体识别的硫酸聚糖可作为恶性胸膜间皮瘤的诊断标志物

• DOI: 10.1007/s00408-022-00531-4
• 发表时间: 2022
• 期刊: Lung
• 影响因子: 5
• 作者: Koki Nakashima;Yasuhiro Sakai;Hitomi Hoshino;Yukihiro Umeda;Hiroto Kawashima;Yoshitaka Sekido;Tamotsu Ishizuka;Motohiro Kobayashi
• 通讯作者: Motohiro Kobayashi