頭頸部扁平上皮癌の神経周囲浸潤：ゲノム編集を用いた腫瘍生物学的解析

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令和４年度(2022年度)は頭頸部扁平上皮癌由来細胞株からゲノム編集によって作ったp63ノックアウト細胞に関して、遺伝子発現の解析を行うとともに、マトリゲルフィルターによる神経周囲浸潤(PNI)のアッセイ系の構築に向けて実験を進めた。成果を以下に要約する。(1) ゲノム編集細胞としてはすでに中咽頭扁平上皮癌由来FaDu細胞株からCRISPR-Cas9法で構築したTP63遺伝子のノックアウト細胞株で、TP63発現全体が停止することが確認されたので、本研究でPNI活性を親細胞と比較する実験に用いることとした。(2) 遺伝子発現のマイクロアレイ解析を行ったところ、ノックアウト細胞は上皮間葉転換（EMT）を示す明確な変化を示した。加えて NEFL, NCAM1、NRCAM、NEUROD2、SEMA3D/4G/5Bほか神経発生と関連する遺伝子発現の大幅な上昇が検出された。その一部についてRT-qPCRとウエスタンブロットで確認を進めた。(3) 神経周辺浸潤（PNI）活性のアッセイ系を構築するために、まず一般的な浸潤アッセイとしてMatrigelチャンバーを用いて、血清を誘因剤として下層に移動する細胞を測定した。浸潤効率はノックアウト細胞で親細胞の2倍に上昇していた。癌組織は不均一な細胞集団であるが、TP63発現が低下してEMTを示す細胞は集団的な浸潤を先導することが最近報告され、その観察と一致している。さらに誘因細胞としてシュワン細胞に由来する細胞株を用いる浸潤アッセイの条件を検討した。