新規合成キスぺプチンを用いた有用魚類の成熟制御に関する研究

我々はこれまでに，全生活史にわたる飼育実験系を整備しているマサバを用いて，マサバは2種のKiss分子（Kiss1およびKiss2）をもつこと，15アミノ酸残基よりなるKiss1-15および12アミノ酸残基よりなるKiss2-12のin vivo投与実験の結果，特に雄魚においてKiss1-15が顕著な成熟促進効果をもつことを明らかにした。しかし，アミノ酸配列情報よりマサバのKiss2はKiss2-12が産生されるが，Kiss1はKiss1-16が産生されることが予想された。本研究では，（1）マサバ脳内で産生され機能するKiss1およびKiss2それぞれの分子サイズを同定し，それらの受容体との結合特性を解析するとともに，（2）特にin vitro投与で成熟促進効果の顕著なKiss1を対象として，一部アミノ酸組成を置換し，native Kiss1より生物活性の高い合成Kiss1を開発する。（1）マサバ脳内におけるKiss分子種の同定：4種合成Kiss（Kiss1-16, Kiss1-15, pKiss1-15およびKiss2-12）の混合試料を逆相クロマトグラフィーで分離し，各ペプチドの溶出時間を求めスタンダードとしたは雌雄成魚およそ100尾の視床下部を氷冷4N AcOH中でホモジナイズした。モジュレートを超遠心し，上清はMW5000の限外ろ過膜をかけて除タンパクを行った。次に，スタンダードと同じ条件でマサバ脳抽出液をHPLCにより分離し，各ペプチドのフラクションを回収した。回収後のフラクションは凍結乾燥を行い保存している。今後は，更に精密な分離が可能なカラムを用いた2段目のHPLC分析を行い，回収した試料のnanoLC/IT-TOF-MSによるMS/MS分析を行い，ペプチドの同定を行う。（2）高活性アゴニストの開発：マサバ脳内におけるKiss分子種の同定が終了したのち，生体投与実験で成熟誘導に効果のあったKiss1を対象として，各アミノ酸残基を1個ずつアラニンに置換して生理活性を検討するアラニンスキャンを行い，活性発現に必須なアミノ酸を検討する予定である。活性はレポーターアッセイで測定する。

我々はこれまでに，全生活史にわたる飼育実験系を整備しているマサバを用いて，マサバは2種のKiss分子（Kiss1およびKiss2）をもつこと，15アミノ酸残基よりなるKiss1-15および12アミノ酸残基よりなるKiss2-12のin vivo投与実験の結果，特に雄魚においてKiss1-15が顕著な成熟促進効果をもつことを明らかにした。しかし，アミノ酸配列情報よりマサバのKiss2はKiss2-12が産生されるが，Kiss1はKiss1-16が産生されることが予想された。本研究では，（1）マサバ脳内で産生され機能するKiss1およびKiss2それぞれの分子サイズを同定し，それらの受容体との結合特性を解析するとともに，（2）特にin vitro投与で成熟促進効果の顕著なKiss1を対象として，一部アミノ酸組成を置換し，native Kiss1より生物活性の高い合成Kiss1を開発する。（1）マサバ脳内におけるKiss分子種の同定：4種合成Kiss（Kiss1-16, Kiss1-15, pKiss1-15およびKiss2-12）の混合試料を逆相クロマトグラフィーで分離し，各ペプチドの溶出時間を求めスタンダードとしたは雌雄成魚およそ100尾の視床下部を氷冷4N AcOH中でホモジナイズした。モジュレートを超遠心し，上清はMW5000の限外ろ過膜をかけて除タンパクを行った。次に，スタンダードと同じ条件でマサバ脳抽出液をHPLCにより分離し，各ペプチドのフラクションを回収した。回収後のフラクションは凍結乾燥を行い保存している。今後は，更に精密な分離が可能なカラムを用いた2段目のHPLC分析を行い，回収した試料のnanoLC/IT-TOF-MSによるMS/MS分析を行い，ペプチドの同定を行う。（2）高活性アゴニストの開発：マサバ脳内におけるKiss分子種の同定が終了したのち，生体投与実験で成熟誘導に効果のあったKiss1を対象として，各アミノ酸残基を1個ずつアラニンに置換して生理活性を検討するアラニンスキャンを行い，活性発現に必須なアミノ酸を検討する予定である。活性はレポーターアッセイで測定する。