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発光酵素変異体を用いた迅速高感度な薬剤探索法の開発

利用发光酶突变体开发快速、灵敏的药物发现方法

基本信息

批准号：
12J40072
负责人：
大室有紀
金额：
$ 1.77万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J40072/
关键词：
蛋白質間相互作用検出系ホタルルシフェラーゼ薬剤探索

项目摘要

蛋白質間相互作用検出系は、創薬・診断など幅広い分野で応用可能な重要技術である。私達は、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)を応用して、新規蛋白質相互作用検出系FlimPIAを構築した。FIucの発光反応は、アデニル化反応とその後に続く酸化的発光反応の2段階に大別できる。FIimPIAでは、アデニル化反応はほぼ正常で、酸化的発光反応が非常に遅いFluc変異体(ドナー)と、逆にアデニル化反応が遅く、酸化的発光反応がほぼ正常な変異体(アクセプタ)を作製し、利用している。当該年度は、FIimPIAの改良を行った。Flucはアデニル化反応から酸化的発光反応に移る際、その構造を変化させる。アクセプタを酸化的発光反応構造に、化学修飾、またはジスフィルド結合で固定した。FlimPIAにおいて最も問題となる、やや高いバックグラウンド発光は、アクセプタの残存アデニル化活性によるため、この改良によりバックグラウンド発光が著しく抑制された。その結果、シグナル/バックグラウンド比が従来のFlimPIAと比較して、約3倍、高くなり、抗炎症剤・抗癌剤であるrapamycinの検出感度が、従来のFlimPIAの約16倍に、蛋白質間相互作用検出系の汎用法であるProtein-fragment Complementation Assay (PCA)の約10倍に向上した。この改良により、薬剤探索の感度・効率を著しく向上できたと考える。

The identification of protein-protein interactions is an important technology that can be used in different fields and applications in the field of creation and diagnosis. We have created a new protein interaction system called FlimPIA. FIuc's 発光濜は, アデニニ化濜とその后に続く's acidified 発光 Reflection's 2-stage に大比できる. FIimPIAでは、アデニニはほぼNormalで、Acidified 発光 Reflectionがvery Fluc variant (ドナー)と, inverse にアデニル化濜が遅く, acidified 発光濜がほぼnormal な変 variant (アクセプタ) をし, use している. In that year, the improvement of FIimPIA will be carried out. Fluc はアデニル chemical reaction から acidified 発光濜に shift る occasion, その structure を変化させる. The acidified photoreflective structure, chemical modification, and またはジスフィルド binding and fixation. FlimPIA's most もquestion となる、やや高いバックグラウンド発光は、アクセプタのRemaining アデニchemical active によるため, この Improved によりバックグラウンド発光が恗く inhibited された.そのRESULTS, シグナル/バックグラウンド比が従来のFlimPIAとComparative して, about 3 times, high くなり, anti-inflammatory agent・anti-cancer agent であるrapam ycinの検出sensitivityが、従来のFlimPIAのapproximately 16 timesに、protein-protein interaction 検出组のGeneral usageであるProtein-fragment Complementation Assay (PCA) is about 10 times higher.この IMPROVEMENT により, 薬艤 Exploration のsensitivity・efficiency をしくUP できたとtest える.