染色体上の特定位置に遺伝子導入できるAAVベクター系の開発

开发可将基因导入染色体上特定位置的 AAV 载体系统

• 批准号: 08877346
• 负责人: 島田 隆
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877346/
• 关键词: 遺伝子治療; 組換えウイルスベクター; アデノ随伴ウイルス; AAVベクター

安全性が非常に高く、非分裂細胞への遺伝子導入も可能であるという遺伝子導入用ベクターとして理想的な特性を有しているAdeno associated virus(アデノ随伴ウイルス:AAV)ベクターもウイルス粒子としてパッケイジングするための導入遺伝子サイズの制約や野生型AAVが持つヒト第19染色体の長腕(q13.4-ter)への部位特異的な挿入が行えない等の問題点を有している。そこで、これらの問題点を克服するための一歩として、AAV蛋白質Rep78遺伝子(1.81.9kb:AAV233-2233;7.8kDa)を大腸菌用融合蛋白質発現ベクター(pMal-c)に組込み、大腸菌内でmaltose binding proteinとRep78のfusion proteinを大量に発現する系を確立し、これを抗原とした抗-Rep78ウサギ・ポリクローナル抗血清を作成した。この抗血清はCAGプロモーターにドライブされたAAV蛋白質Rep78遺伝子を持つプラスミドを293細胞へ遺伝子導入して得た核抽出分画のウエスタン分析において、市販のAAV Rep proteinモノクローナル抗体(PROGEN;226.7)と同一のバンドを認識し、大腸菌で、Rep蛋白質が発現している事を確認した。このRep fusion proteinを血液凝固因子Xaにて加水分解すると、ほぼRep78蛋白質に相当する分子量約76kDaが分離できた。発現させたfusion proteinおよび分子量約76kDの蛋白質の1)ATP-dependent DNA helicase活性、2)AAVS1-specific DNA binding活性、3)ITR binding活性などの生理活性を検討したが、Positive controlがうまく取れないため、明確な活性を証明できなかった。現在、Rep fusion proteinをHeLa細胞、293細胞へAAVベクター遺伝子と伴にリポフェクションによって導入し、部位特異的な挿入が行えるかを検討中である。また、センダイウイルスの膜融合能を持つ単層リポゾーム内にAAVベクター遺伝子と、AAV非構造蛋白質のRep78とを抱合させたSendai virosomesを用いて導入する方法をNakanishiら共同で行う予定である。

Safety is very high, non-dividing cell vector introduction is possible, and there are desirable characteristics for vector introduction. Adeno associated virus(AAV) has the ability to control wild type AAV, such as the site-specific insertion of the long arm of chromosome 19 (q13.4-ter). A step to overcome these problems was to establish a system for the development of fusion protein (pMal-c) for E. coli using the AAV Rep78 gene (1.81.9kb:AAV233-2233;7.8kDa), and to develop an antiserum for E. coli containing malose binding protein and Rep78 fusion protein. The antiserum was used to detect the presence of AAV Rep78 protein in CAG, and to confirm the presence of E. coli and Rep protein in 293 cells. The Rep fusion protein is a protein equivalent to blood coagulation factor Xa, which has a molecular weight of approximately 76kDa. A fusion protein with a molecular weight of approximately 76kD was discovered and 1)ATP-dependent DNA helicase activity, 2)AAVS1-specific DNA binding activity, 3)ITR binding activity, physiological activity, and Positive control activity were identified. Now, Rep fusion protein is introduced into HeLa cells, 293 cells and AAV cells. The membrane fusion of AAV and AAV non-structural proteins can be carried out in a single layer. The method of introducing Sendai virosomes is determined by Nakanishi.

项目成果

Shimada,T.: "Targeted gene transfer into CD4 positive cells by HIV based retrovital vevtors." Molecular Biology of Hematopoiesis. 323-329 (1996)

Shimada,T.：“通过基于 HIV 的逆转录病毒载体将基因定向转移到 CD4 阳性细胞中。”

Tamayose,K.: "A new strategy for large scale preparation of high titer recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors by using packaging cell lines and sultonated column." Human Gene Therapy. 7. 507-513 (1996)

Tamayose,K.：“通过使用包装细胞系和磺化柱大规模制备高滴度重组腺相关病毒 (AAV) 载体的新策略。”

Obaru,K.: "Gene therapy for adult T cell leukemia using human immunodeficiency virus vector carrying the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1." Human Gene Therapy. 7. 2203-2208 (1996)

Obaru,K.：“使用携带 1 型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的人类免疫缺陷病毒载体对成人 T 细胞白血病进行基因治疗。”

Shimada,T.: "Current status and future prospects of human gene therapy." Acta Pediatrica Japonica. 38. 176-181 (1996)

Shimada,T.：“人类基因治疗的现状和未来前景。”

Miyake,K.: "Two step gene transfer using adenovirus vector carring the CD4 gene and HIV vectors." Human Gene Therapy. 7. 2281-2287 (1996)

Miyake,K.：“使用携带 CD4 基因的腺病毒载体和 HIV 载体进行两步基因转移。”