特定の染色体部位に組み込まれる遺伝子導入法の開発

开发整合到特定染色体位点的基因转移方法

• 批准号: 09877452
• 负责人: 島田 隆
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877452/
• 关键词: 遺伝子治療; 組換えウイルスベクター; アデノ随伴ウイルス; AAVベクター; 部位特異的挿入

アデノ随伴ウイルス(AAV)の持つヒト第19染色体長腕(q13.4-ter)への特異的に挿入機構を利用して、その特定の領域(AAVS1)に遺伝子ターゲティングできる遺伝子導入法を開発することを目的とした。AAVベクターがAAVS1領域に挿入されるために必須であるが細胞毒性を持つRep蛋白を必要な時だけ短期間に発現させるために、Rep遺伝子をBacteri ophage P1のCre/Lox P系を利用した発現プラスミド(pLRPL)として構築した。このpLRPLプラスミドとCre発現プラスミドおよびITRを持つAAVベクタープラスミドとをそれぞれリポソーム法にてヒト由来の293細胞へ導入したところ、Creの発現に依存したRep蛋白の発現が生じることを確認した。短期間だけ発現するRep蛋白の作用でAAVベクターがAAVS1領域に特異的に挿入さたることをAAVS1とAAVベクターのITRのプライマーを用いるnested-PCR法およびAAVS1領域に設定したオリゴ・ヌクレオチドをプローブとして用いたサザンブロット法により、部位特異的挿入を確認した。Direct-sequenceによりITRおよびAAVS1内の挿入部位を検討したところ、挿入部位はITR部分およびAAVS1部分ともに既報の野生型AAVの挿入部位と類似していた。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子導入用のAAVベクタープラスミドを用いて、293細胞のAAVS1領域への導入効率を検討したところ、ネオマイシン耐性コロニーの12%に部位特異的遺伝子導入が認められた。

The specific insertion mechanism of chromosome 19 long arm (q13.4-ter) is utilized to develop the gene introduction method in a specific domain (AAVS1). AAV is the first to enter the AAVS1 domain. It is necessary to develop a cytotoxic Rep protein when necessary. It is necessary to develop a Rep protein in the short term. The Rep protein is used to develop a Cre/Lox P system for Bacteriophage P1 (pLRPL). The pLRPL gene expression and Cre expression are dependent on the ITR gene expression and AAV gene expression. The role of Rep protein in short-term development was identified by nested-PCR for AAVS1 and AAVS1 domain-specific ITR. Direct-sequence analysis of ITR and AAVS1 entry sites is similar to that of wild-type AAV. AAV vector selection for gene transfer into AAVS1 domain was investigated in 293 cells and 12% of site-specific gene transfer into AAVS1 domain was identified.

项目成果

Orimo,H: "Detection of Delection 1154-1156 Hypophosphatasia Mutation Using INSALP Exon Amplification." GENOMICS. 42. 364-366 (1997)

Orimo,H：“使用 INSALP 外显子扩增检测缺失 1154-1156 低磷酸酯酶症突变。”

Shimada,T.: "HIV vector mediated gene transfer into CD4 positive cells." Animal Cell Technology. 9. 313-317 (1997)

Shimada,T.：“HIV 载体介导的基因转移到 CD4 阳性细胞中。”

Matsukura,N: "Gene therapy for gastric cancer:in situ use of suicide gene for canine gastric cancer treatment" Progress in GASTRIC CANCER RESEARCH. 673-676 (1997)

Matsukura，N：“胃癌的基因治疗：原位使用自杀基因治疗犬胃癌”胃癌研究进展。

Hayashi,Z: "Prenatal diagnosis of steroid 21-Hydroxy lase deficiency by analysis of polymerase cnain reaction -singel strand conformation polymrphism(PCR-SSCP)profiles" PRENATAL DIAGNOSIS. 17・5. 435-442 (1997)

Hayashi, Z：“通过聚合酶链反应 - 单链构象多态性 (PCR-SSCP) 分析对类固醇 21-羟基激光酶缺乏症进行产前诊断” 产前诊断 17・5 (1997)。