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リボザイムを用いた血管作動性ペプチド遺伝子"knock down"マウスの開発-テトラサイクリン誘導遺伝子発現システムのin vivoへの応用

利用核酶开发血管活性肽基因“敲低”小鼠——四环素诱导基因表达系统的体内应用

基本信息

批准号：
08877155
负责人：
伊藤裕
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.TGF-βは、アンジオテンシンII等血管作動性ペプチドにより遺伝子発現が制御され、それら血管作動性ペプチドの血管平滑筋細胞増殖調節に関与する。TGF-βのmRNAに対する2種類の1本鎖ハンマーヘッド型リボザイムを構築し、更に、通商産業省工業技術院多比良博士との共同研究により得た、リボザイム大量発現ベクター(細胞質内での分解を防ぐため細胞内で安定であるtransfer RNA構造の中にリボザイムを組み込む)に組み換え、これを用いてin vitroでTGF-βmRNAを高率に切断させることに成功した。2.我々が報告した新しい内皮由来血管弛緩ペプチドであるC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)cDNAをアデノウィルスに組み込み培養血管平滑筋細胞(VSMC)に感染させCNPを過剰発現させることで、cGMPカスケードが活性化されVSMCがG1期増殖抑制を受けることを明らかにした。更に、ラビット大腿動脈にCNP遺伝子組み換えアデノウィルスを感染させ、生体血管壁へCNP遺伝子を導入することにより、バルーンカテーテルを用いた血管壁損傷後の新生内膜増殖が著明に抑制されることを明らかにした。3.CNP過剰発現によるcGMPカスケードの活性化により、新しい心血管系特異的ホメオボックス遺伝子であるGax(Growth Arrest-specific Homeobox)遺伝子が活性化されることを明らかにした。更に、Gax mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、培養VSMCにtransfectionさせることにより、Gaxの遺伝子発現を特異的に抑制すると、cGMPカスケードによるVSMC増殖抑制がほぼ完全にブロックされることを明らかにした。4.cGMPカスケードによる細胞増殖抑制作用のメディエーターであるヒトcGMP依存性プロティンキナーゼ(Gキナーゼ)タイプI α cDNA全長のクローニングに成功した。更に、Gキナーゼ大量発現ベクターを構築し、細胞増殖抑制効果を確認した。更に、Gキナーゼ過剰発現トランスジェニックマウスを開発中である。5.現在、2-4で得た知見をもとに、1で得たリボザイムに関する実験手技をもとに、CNP、Gキナーゼ及びGax mRNAに対するリボザイムを構築し、テトラサイクリン誘導型ベクターへ組み込みそのVSMC増殖に対する効果を検討中である。更に、4で得た発生工学的手法をもとに、テトラサイクリン誘導発現システムを用いたcGMPカスケード遺伝子の"knock down"マウスの開発を計画している。

1. TGF-β, TGF-β, TGF-β, A joint study conducted by Dr. Tobira, Institute of Industry and Technology, Ministry of International Trade and Industry, found that a large number of TGF-βmRNA molecules were found in two types of mRNA molecules (intracellular decomposition prevention, intracellular stability, transfer RNA structure), which were successfully isolated from TGF-βmRNA at a high rate. 2. We report new developments in endothelial-derived vascular relaxants (ECV), C-type CNP (CNP)cDNA, and its expression in cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with CNP. In addition, the gene expression of CNP in the femoral artery was inhibited by the gene expression of CNP in the vascular wall. 3. CNP gene expression is related to the activation of cGMP gene, which is new to cardiovascular system-specific gene expression. In addition, the expression of Gax mRNA was specifically inhibited by the production of Gax mRNA, the transfection of Gax mRNA, and the complete inhibition of VSMC proliferation by cGMP. 4. The cGMP dependent gene expression was successfully detected in the full-length cDNA of I α. In addition, a large number of cell growth inhibition effects have been identified. In addition, G 5. Now, 2-4, we got the information about the gene expression, CNP, G, and Gax mRNA, and we got the information about the gene expression, the gene expression, and the VSMC gene expression. In addition, the "knock down" of the cGMP gene was developed by means of biological engineering.